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沙棘对双酚A染毒小鼠卵巢AMH基因表达影响的研究

2025-04-26 85 上传者：管理员

摘要：目的探讨沙棘干粉对卵巢暴露于双酚A(BPA)的损伤修复作用。方法60只雌性小鼠（昆明白）随机分为5组，空白对照组、模型组和3个实验组，每组12只。后4组灌胃BPA建立小鼠染毒模型，造模成功后3个实验组分别给予10、20和30mg/kg体重的沙棘干粉灌胃处理，模型组灌胃等体积的生理盐水。苏木精-伊红（HE）染色观察各组卵巢组织结构变化，ELISA检测小鼠血清中抗苗勒管激素（AMH）含量的变化特征，定量PCR检测卵巢中AMH的mRNA表达变化，Westernblot检测卵巢中AMH的表达变化，免疫组化染色观察卵巢中AMH位置特征。结果与模型组相比实验组随着沙棘干粉浓度增加，不同发育阶段的卵泡增多，颗粒细胞层数逐渐增多，组织结构完整，卵泡细胞大而圆，细胞质丰富。与模型组AMH表达量（0.49±0.12）相比，实验组小鼠血清中随着沙棘干粉浓度增加AMH表达量增加，10、20和30mg/kg沙棘干粉组分别为0.51±0.08、0.58±0.11和0.56±0.13),20mg/kg组差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组相比，实验组AMHmRNA的表达随着沙棘浓度的增加而增加，20mg/kg组差异有统计学意义（P<0.01）,10mg/kg组差异也有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，随着沙棘干粉浓度增加AMH蛋白表达量增加，20mg/kg组差异有统计学意义（P<0.01）。结论沙棘干粉可有效缓解BPA暴露诱导的小鼠卵巢损伤，使AMH的表达量增高，特别是20mg/kg沙棘干粉浓度效果更好。

关键词：
卵巢
双酚A
双酚丙烷
抗苗勒管激素
沙棘
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双酚A（Bisphenol‐A，BPA）是世界上生产量最大的化学产品之一。其学名为2，2‐二（4‐羟基苯基）丙烷，简称双酚丙烷。它广泛存在于矿泉水瓶和食品包装等日常塑料制品中，也是重要的环境内分泌干扰物之一［1］。双酚A的化学结构与雌激素类似，通过不同的方式影响人类内分泌和代谢，导致代谢紊乱。BPA主要通过皮肤、呼吸道等途径进入人体，会对神经系统、免疫系统、内分泌系统和生殖系统等多个系统造成不良影响［2］。研究报告显示双酚A可以诱导雌性小鼠生殖系统的形态和功能改变，尤其是卵巢的变化与环境中双酚A的剂量有关［3］；另一项研究显示长期摄入10mg/（kg·d）剂量的双酚A可引起大鼠生殖系统功能损伤、过氧化应激等［4］。BPA通过影响颗粒细胞的功能来降低雌激素浓度，进而影响卵泡细胞的生长和卵母细胞的成熟，最终减少卵巢储备［5］。抗苗勒管激素（Anti‐Müllerianhormone，AMH）是一种卵泡生长调节因子，在人类卵泡发生过程中起着重要的作用［6］，AMH是由生长卵泡产生的，AMH在滤泡细胞中高表达，并随着生殖细胞的消失而减少，血清AMH水平与有腔卵泡数量呈正相关，因血清AMH特异性和敏感度均较高，常用于评估卵巢储备功能。生活当中我们通过各种途径都在接触含有双酚A类的物质，因此，如何缓解由双酚A等环境因素导致的疾病是近年来研究热点。沙棘果实中的蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质等生物活性物质具有抗癌、增强免疫力、抗炎、抗菌、调节血脂、预防血栓形成等多种功效［7‐8］。另外有研究显示沙棘籽油不仅可以预防放化疗引起的小鼠卵巢损伤、动情周期的紊乱，还可以有效改善卵巢储备功能等。本文以双酚A染毒青春期昆明小鼠建立卵巢功能损伤模型通过检测小鼠血清中AMH（一种可代表卵泡储备功能的激素）含量的变化特征，探讨沙棘干粉匀浆对卵巢卵泡的损伤修复作用及可能机制。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

60只21日龄无特定病原体（SPF）级雌性昆明种（KM）小鼠，体质量为（23.24±2.52）g。

1.1.2主要药品与试剂

BPA（批号B802575，纯度>99.0%）购自上海麦克林生化科技有限公司；兔源AMH受体（AMH多克隆抗体（批号ab31376，美国Abcam）、兔源β-肌动蛋白（β‐actin）单克隆（批号13E5，美国CST）、DAB显色试剂盒（批号DAB‐0031，福州迈新）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批号ab6721，英国Abcam）、AMH试剂盒（批号ab318930，美国Abcam），等。

1.1.3主要仪器

CFX96Touch型实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（罗氏诊断产品，上海）、MultiskanFC型酶标仪（美国ThermoFisherScien‐tific）、E100型全自动正置数码显微镜（日本Nikon）、RM2235型石蜡切片机（德国Leica）等。

1.2方法

1.2.1动物分组与处理方法

60只小鼠随机分为对照组（n=12只）和BPA处理组（n=48只）。小鼠于新疆第二医学院动物实验中心饲养在自然光照、保持良好的室内通风的动物房，饲喂普通饲料，自由饮食。适应性喂养1周后，BPA处理组10mg/kg的双酚A（玉米油溶解）给药，每天一次，连续灌胃给药3周，构建小鼠暴露模型。对照组灌胃给予相同剂量的玉米油。小鼠染毒模型评估：①日常状态评估：从小鼠的毛色、饮食量、精神状态等方面观察模型组小鼠与空白对照组小鼠的日常情况，进行比较，做好记录；②通过卵巢组织苏木精伊红（HE）染色，颗粒细胞层不完整，出现裂隙等病理改变；③小鼠卵巢细胞凋亡增高表明建模成功。购买沙棘冻干全果粉，建模成功后，将BPA处理组小鼠随机分为4组，每组12只，其中3组灌胃不同计量（10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg）的沙棘干粉（生理盐水溶解），分别灌胃3周，每日1次；对照组通过灌胃等体积的生理盐水。最后1次灌胃后禁食24h。每日1次经口灌胃，模仿最可能的途径连续3周，处理后采集小鼠卵巢样品待检测。

1.2.2样品的处理

最后一次给药处理完将4组实验小鼠处死，收集4组小鼠眼球血用试剂盒分别检测4组的AMH激素含量。从4组实验小鼠中随机挑选5只，摘取单侧卵巢放置于固定液中，用于组织观察和免疫组化分析。另侧卵巢摘除后迅速放入液氮中冷冻。其他实验小鼠的卵巢摘除后储存在-80℃用于后期提取RNA定量分析。

1.2.3卵巢的组织切片及观察

分别对前期收集固定的4组实验小鼠的卵巢样品分别进行脱水，包埋，切片，脱蜡，复水。对不同样品的卵巢组织行苏木精‐伊红（HE）染色，观察卵泡的形态、数量等。比较不同浓度沙棘处理后小鼠卵巢各级卵泡、黄体等结构的差异。

1.2.4免疫组化染色

石蜡切片脱蜡水化，将切片与多克隆AMH抗体（1∶100稀释；在4℃下孵育过夜。在用TBS洗涤载玻片3次后，将生物素化的第二抗体和辣根过氧化物酶（HRP）缀合的链霉亲和素添加到卵巢切片上。用3，3二氨基联苯胺（DAB）底物观察表达，并在显微镜下观察，苏木精重新染色、脱水、封片、观察、拍照。

1.2.5血清学检测

离心分离血清后分装于EP管内-20℃冰箱保存备用。根据试剂盒说明书步骤ELISA法测定血清AMH水平。

1.2.6荧光定量PCR检测卵巢中AMH的表达

将前面收集的不同实验组的卵巢标本从-80℃取出，然后根据RNA提取说明书进行抽提取总RNA。取1μg总RNA，按照反转录说明书合成cDNA后，根据Primer5.0自行设计引物，上游引物为：TGGTTTTGTTACGAAATGTCC；下游引物为：CCTTACATTGAAGAAGCATTG。按照以下条件扩增引物，预变性95℃6min；变性95℃10s；退火60℃60s；延伸72℃10s；共45个循环。用2‐△△CT法分析表达量。

1.2.7Westernblot检测卵巢中AMH蛋白的表达

将储存在-80℃冰箱中不同时期样品取出，加入100mL2×样品缓冲液，100℃沸水浴10min，取上清液进行12％SDS‐PAGE。电泳结束后低温下2h将蛋白质固定在1张PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液4℃封闭过夜。第2天再用TBST缓冲液清洗4次，将膜放于AMH一抗（1∶500）中孵育2h，TBST缓冲液清洗4次。将膜放入羊抗鼠二抗（1∶5000）孵育1h，TBST缓冲液洗膜4次，之后用TBST缓冲液洗膜4次，放入10000倍稀释的一抗中室温孵育2h，TBST缓冲液洗膜4次，再将膜放入10000倍稀释的二抗中室温孵育1h，DAB显色液（福建迈新，DAB‐0031）显色1~2min，拍照观察。

1.3统计学分析

采用SPSS22.0软件，对数据进行单因素方差分析，多组间采用LSD‐t检验，定量数据以均值±标准误显示，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1不同浓度沙棘干粉对小鼠卵巢组织结构的影响

普通光学显微镜下实验组较模型组小鼠卵巢组织结构异常卵泡的比例逐渐减少，颗粒细胞层出现不规则裂隙较少，颗粒细胞层数增多；实验组卵巢切片可观察到各时期的卵泡，及整齐的颗粒细胞，随着沙棘干粉浓度的增加，不同发育阶段的卵泡增多，颗粒细胞层数逐渐增多，组织结构完整，卵泡细胞大而圆，细胞质丰富；30mg/kg沙棘干粉组与20mg/kg沙棘干粉组卵泡的数量和颗粒细胞的层数无明显的差别（图1）。

图1不同剂量沙棘干粉匀浆对BPA暴露小鼠卵巢组织形态的影响

2.2免疫组织化学结果

免疫组化结果显示AMH在卵巢的颗粒细胞中表达呈棕黄色颗粒状（图2）。与模型组相比，随着沙棘干粉浓度的增加卵泡颗粒细胞的阳性信号数量表达逐渐增加。

图2不同剂量沙棘干粉对BPA暴露小鼠卵巢组织中AMH的表达

2.3血清学检测

AMH水平ELISA试剂盒检测血清AMH表达显示，对照组小鼠血清中AMH含量显著高于模型组（BPA处理，t=5.044，P<0.01），20mg/kg沙棘组处理后AMH水平显著高于模型组（t=4.173，P<0.01），30mg/kg沙棘组AMH水平显著高于模型组（t=2.016，P=0.024）（图3）。

2.4AMH在不同组间表达趋势

荧光定量PCR和Westernblot检测卵巢中AMHmRNA和蛋白的表达。AMHmRNA结果表明：与模型组相比实验组AMHmRNA的表达随着沙棘浓度的增加而增加，在20mg/kg时差异有统计学意义（t=5.178，P<0.01），在10mg/kg时差异有统计学意义（t=4.173，P<0.05）。AMH蛋白结果表明：模型组与灌胃10mg/kg、30mg/kg沙棘组蛋白表达差异有统计学意义（t=4.112，P<0.01）。不同实验组之间随着沙棘浓度的增加，蛋白的表达逐渐增加，但差异无统计学意义（P>0.05）（图4）。

图3不同浓度沙棘处理后血清AMH的表达

图4不同浓度沙棘处理后AMHmRNA和蛋白的表达

3、讨论

世界人口的增长和工业生产活动的增加带来了严重的环境污染问题，许多环境雌激素可以在内分泌系统功能的机制中发挥作用，并可以通过激素对正常的内分泌系统功能产生不利影响［9‐10］。人类每天都会受到各种内分泌干扰物的干扰，这会对健康产生不利影响。其中，BPA是最有争议的内分泌干扰物，因它对生育的影响引起了大家的重视［11］。流行病学表明，在采集的尿样中90%以上可检出BPA［12］。本研究通过建模组观察卵巢组织，发现BPA诱导了严重的卵巢毒性。

卵泡是卵巢的主要功能单位，受垂体、促性腺激素和性激素的控制。卵巢中的大部分卵泡不能成熟，只有优势卵泡才能最终发育成成熟卵泡，完成排卵过程［13］。本研究结果发现，BPA暴露损害卵巢组织结构，对照组卵巢组织结构正常。在BPA作用下，颗粒细胞结构出现松动、水肿、变性、核固缩和核碎裂。颗粒细胞与膜细胞之间的间隙明显变宽，黄体细胞结构疏松。

AMH的合成来源于窦前卵泡和窦状小卵泡的颗粒细胞，是由窦前卵泡和窦状小卵泡颗粒细胞产生的糖蛋白［14］。其表达伴随着卵泡发生的两个主要调控步骤，首先出现在初级卵泡的颗粒细胞中，在窦前卵泡和窦状小卵泡中最强［15］。已知BPA对卵母细胞成熟过程和减数分裂细胞分裂机制有不利影响，损害卵母细胞存活，抑制卵泡生长并减少卵巢储备［16］。AMH的表达量在闭锁卵泡中较低，提示AMH的表达量可能在原始卵泡向生长卵泡的发育过程中有着非常重要的作用［17］。另有研究显示，亚慢性接触BPA可降低小鼠卵巢AMH的表达量，进而影响卵泡细胞的生长和卵母细胞的成熟，提示BPA可引起卵巢颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁，最终减少卵巢储备［18］。BPA通过降低卵巢颗粒细胞的活性，加速其凋亡，从而导致AMH合成减少，同时血清中AMH水平也降低。我们的研究结果显示沙棘干粉降低了BPA导致卵巢损伤，表现为卵巢颗粒细胞增多，初级卵泡、次级卵泡数增加，闭锁卵泡数减少。可能是沙棘的药理作用提高了颗粒细胞的活性，使颗粒细胞的功能得到改善，合成的AMH量增加，所以本文检测到实验组血清中AMH的表达量、卵巢AMHmRNA和AMH蛋白表达量与模型组是显著升高的。

本研究也确定BPA与卵巢储备减少可能有关。通过成功建立中毒模型后，观察对照组与模型组相比血清中AMH的表达量、卵巢AMHmRNA和AMH蛋白表达量差异是显著的。使用不同浓度的沙棘干粉灌胃小鼠，减轻了由BPA造成的氧化损伤，并且随着沙棘干粉浓度的升高，修复作用越强，沙棘可以有效改善卵巢储备功能。当AMH缺乏时，原始卵泡会以更快的速度增加，导致卵泡池过早成熟，缩短生殖寿命［19］。

沙棘对BPA诱导的小鼠卵巢储备功能损伤的缓解作用，目前国内外报道的很少，这项研究的结果可能有助于阐明沙棘对双酚A暴露与生殖健康关系提供建议与参考，具有一定的理论和实际意义。

参考文献:

[9]温国辉,孙志豪,李庆.血清抗缪勒氏管激素(AMH)诊断多囊卵巢综合征的价值观察[J].中国医药科学,2018,8(20):114‐116.

[10]唐姣美,周群莉,梁爱心,等.AMH对哺乳动物繁殖性能影响的研究进展[J].中兽医医药杂志.2019,38(3):90‐94.

基金资助:新疆维吾尔自治区高校科研计划项目(XJEDU2021Y055);

文章来源:蒋香菊,张利,胡欢欢,等.沙棘对双酚A染毒小鼠卵巢AMH基因表达影响的研究[J].解剖学研究,2025,47(02):140-145.