首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 卵巢癌论文 > 羽扇豆醇对人卵巢癌SKOV3细胞增殖､迁移及侵袭的影响

羽扇豆醇对人卵巢癌SKOV3细胞增殖､迁移及侵袭的影响

2025-03-21 69 上传者：管理员

摘要：目的研究羽扇豆醇对人卵巢癌SKOV3细胞增殖､迁移及侵袭的影响｡方法以人卵巢癌SKOV3细胞为研究对象,根据加入羽扇豆醇浓度不同分为四组:对照组(0μmol/L)､低剂量组(20μmol/L)､中剂量组(40μmol/L)､高剂量组(80μmol/L);用MTT法检测细胞的增殖能力;用划痕实验检测细胞的迁移能力;用Transwell法检测细胞的侵袭能力;用Western blot检测PCNA､ASAP1蛋白的表达｡结果与对照组相比较,不同剂量组羽扇豆醇干预后的人卵巢癌SKOV3细胞增殖､迁移及侵袭能力均明显下降(P<0.05),且对羽扇豆醇呈剂量依赖性(P<0.05);与对照组相比较,不同剂量组羽扇豆醇干预后的人卵巢癌SKOV3细胞中PCNA､ASAP1蛋白的表达量均明显下降(P<0.05),且对羽扇豆醇呈剂量依赖性(P<0.05)｡结论羽扇豆醇可抑制人卵巢癌SKOV3细胞株的增殖､迁移及侵袭能力,其作用的机制可能通过下调PCNA与ASAP1蛋白的表达有关｡

关键词：
ASAP1
PCNA
中药复方､
人卵巢癌SKOV3细胞
羽扇豆醇
加入收藏

瘤细胞减灭术和化疗效果均不理想,近年来中药复方､中成药及中药注射液在恶性肿瘤治疗中发挥着无法取代的作用,而中药单体作为上述中药的研究基础,拥有靶点广泛､临床疗效较好､毒副作用较低等优点｡羽扇豆醇是提取于中草药和食源性植物的一种单体化合物,蒲公英等中药内可以有效提取羽扇豆醇,研究[1]表明蒲公英联合化疗药比单用化疗药治疗中晚期卵巢癌更能明显缩小癌灶｡近年来,研究[2]发现羽扇豆醇对肺癌､肝癌､结肠癌､骨肉瘤等多种恶性肿瘤具有杀伤或抑制作用,其药理学活性主要表现为抑制肿瘤细胞增殖､迁移及侵袭,阻滞细胞周期,诱导肿瘤细胞凋亡等方面｡癌细胞增殖受细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)的调节,PCNA增殖指数越高,细胞分裂增殖越快｡癌细胞的迁移和侵袭受二磷酸腺苷·344· GUIZHOU YIYAO,2025,Vol.49,No.3核糖化因子鸟苷酸激酶1(adenosinediphosphateribosylationfactorguanylatekinase1,ASAP1)的调节,ASAP1过表达能明显增加癌细胞迁移及侵袭能力｡本研究选取人卵巢癌SKOV3细胞作为研究对象,分四组加入不同浓度的羽扇豆醇处理后,用MTT法检测细胞增殖能力,用划痕实验检测细胞迁移能力,用Transwell法检测细胞侵袭能力,用Westernblot法检测PCNA､ASAP1蛋白的表达,探讨羽扇豆醇对卵巢癌细胞增殖､迁移及侵袭的影响,为进一步研究羽扇豆醇对卵巢癌的治疗作用提供理论及实验依据｡

1､材料与方法

1.1细胞与试剂

人卵巢癌SKOV3细胞株购于普诺赛公司｡羽扇豆醇购于Sigma公司;McCoy＇s5A培养基购于普诺赛公司;MTT试剂盒购于碧云天公司;Transwell小室购于康宁公司;Matrigel基质胶购于BD公司;特级胎牛血清购于生工公司;无血清细胞冻存液购于新赛美公司;胰酶､BCA蛋白定量试剂盒､5×蛋白上样缓冲液､PVDF膜0.45μm､无蛋白快速封闭液､PBS缓冲液､5×SWE快速高分辨电泳缓冲液､Tween､ECL显影试剂､RIPA裂解液､PMSF(100 mM)均购于Servicebio公司;SDSPAGE凝胶试剂盒购于诺唯赞公司;蛋白Marker购于雅酶公司;10× 快速转膜液购于中晖赫彩公司;甲醇购于SUN公司;PCNA抗体购于Novus公司;ASAP1抗体购于赛默飞公司;GAPDH购于戴格公司｡

1.2方法

1.2.1分组

以人卵巢癌SKOV3细胞为研究对象,根据加入羽扇豆醇浓度不同分为四组:对照组(0μmol/L)､低剂量组(20 μmol/L)､中剂量组(40μmol/L)､高剂量组(80μmol/L)｡

1.2.2细胞培养

于37℃､5%二氧化碳､湿度饱和的培养箱中,将人卵巢癌SKOV3细胞株置于含有特级胎牛血清(FBS)的McCoy＇s5A培养基中培养,当SKOV3细胞生长融合到占培养基面积80%~90%时,弃去培养基,根据1:3的比例用胰酶消化传代｡

1.2.3 MTT实验

取复苏后的第三代对数期人卵巢癌SKOV3细胞,分别以7×103个/孔接种于96孔板中,每个浓度使用3个复孔,放置于37℃､5%二氧化碳以及湿度饱和培养箱中进行培养,等细胞贴壁时,弃除旧的培养基,然后分别加入羽扇豆醇0､20､40､80μmol/L进行培养48h,后续的操作严格按试剂盒的说明书进行｡用酶标仪设置波长为450nm,检测各组的吸光度值(OD),OD值越高代表细胞的数目越多｡并计算出SKOV3细胞的增殖抑制率(%)= [1- (处理组OD值-空白组OD值)]/(对照组OD值-空白组OD值)×100.00%｡

1.2.4细胞划痕实验

取复苏后的第三代对数期人卵巢癌SKOV3细胞,置于12孔板中进行培养,待SKOV3细胞融合率达到约80%~90%时,将枪头垂直孔板划痕,用PBS缓冲液洗去划下的细胞,分别加入羽扇豆醇终浓度为0､20､40､80μmol/L的无血清培养基继续培养｡用光学显微镜下分别在0h和48h时拍摄细胞划痕愈合的情况,并运用ImageJ软件测量细胞间的距离均值｡SKOV3细胞迁移率(%)=(0h测量宽度-48h测量宽度)/0h测量宽度×100.00%｡

1.2.5 Transwell实验

取复苏后的第三代对数期人卵巢癌SKOV3细胞,用无血清的培养基根据1:3的比例稀释Matrigel基质胶,取30μL加入Transwell小室中,并在37℃培养箱内孵育1h,待Matrigel基质胶凝固后,除去Transwell小室内多余的液体,并分别于上室和下室内加入90､550μL的无血清培养基,置于37℃培养箱内过夜｡计数1×104个细胞,用90μL无血清的培养基进行重悬,加入Transwell小室的上室,在细胞悬液中分别加入终浓度为0､20､40､80μmol/L的羽扇豆醇｡在Transwell小室的下室中加入含特级胎牛血清的完全培养基550μL,每个浓度使用3个复孔｡于37℃､5%二氧化碳以及湿度饱和的培养箱中孵育48h后,取出Transwell小室,用棉签仔细擦去上室中的细胞,在光学显微镜下用200倍视野观察穿过滤膜的细胞,对5个视野的SKOV3细胞进行计数,重复计数3次并取平均值｡

1.2.6 Westernblot法检测

取复苏后的第三代对数期人卵巢癌SKOV3细胞,分别用含羽扇豆醇浓度为0､20､40､80μmol/L的培养基培养36h后,分别收集各组中所有细胞,在冰上用蛋白裂解液裂解25min,置于4℃和12000r/min的离心机中离心15min,收集上清液,并以此作为细胞蛋白总量｡用BCA法检测总蛋白浓度,配胶､上样､电泳､转膜､切膜､用封闭液封闭1.5h,一抗PCNA､ASAP1及GAPDH在4℃环境下孵育过夜,二抗于室温孵育1.5h,用Bio-Rad成像仪进行拍照,用GAPDH条带作为内参,用ImageJ软件对各条带进行灰度值分析,计算出各组SKOV3细胞中PCNA､ASAP1蛋白的相对表达量｡实验必须重复3次或以上,并进行绘图及统计学分析｡

1.3统计学方法

每个实验需重复至少3次,所有得出的数据均用(x- ±s)表示｡采用GraphPadPrism9.5.1软件对所有数据进行统计学分析和处理｡采用Student＇st-test进行两组间的差异性分析,应用方差分析进行多组间比较｡采用Prism软件(Graphpad9.0)绘图,以P<0.05为差异有统计学意义｡

2､结果

2.1人卵巢癌SKOV3细胞增殖

MTT实验结果显示,与对照组相比较,羽扇豆醇低剂量组､中剂量组､高剂量组中SKOV3细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.05),且随着羽扇豆醇各剂量组浓度的升高,对细胞增殖的抑制作用显著增强(P<0.05)｡见图1｡100806040200-20对照组低剂量组中剂量组高剂量组抑制率%aaabbc注:与对照组相比,低剂量组､中剂量组､高剂量组的细胞增殖抑制率均明显增高,aP<0.0001;中剂量组､高剂量组与低剂量组相比,bP<0.0001;高剂量组与中剂量组相比,cP<0.0001｡图1 MTT法检测羽扇豆醇对各组的抑制率

2.2人卵巢癌SKOV3细胞迁移

细胞划痕实验结果显示,与对照组相比较,羽扇豆醇低剂量组､中剂量组､高剂量组中SKOV3细胞的迁移率均显著降低(P<0.05),且随着羽扇豆醇各剂量组浓度的升高,细胞的迁移率显著降低(P<0.05)｡见图2｡

图2划痕实验检测各组的迁移率

2.3人卵巢癌SKOV3细胞侵袭

Transwell实验结果显示,与对照组相比较,羽扇豆醇低剂量组､中剂量组､高剂量组中SKOV3细胞的侵袭数目均显著降低(P<0.05),且随着羽扇豆醇各剂量组浓度的升高,细胞侵袭数目显著下降(P<0.05)｡见图3｡

图3 Transwell实验检测侵袭细胞数(20×)

2.4人卵巢癌SKOV3细胞中PCNA､ASAP1蛋白表达

Westernblot实验结果显示,与对照组相比较,羽扇豆醇低剂量组､中剂量组､高剂量组中PCNA及ASAP1蛋白的相对表达量均显著降低(P<0.05),且随着羽扇豆醇各剂量组浓度的升高,PCNA及ASAP1蛋白表达量均显著下降(P<0.05)｡见图4､图5｡

图4 Westernblot法检测各组中PCNA､ASAP1蛋白的表达

图5各组中PCNA､ASAP1蛋白相对表达量

3､讨论

卵巢癌是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤,患者5年的生存率仅为39%[3],因发病较隐匿,大多数患者到晚期才就医,经系统的肿瘤细胞减灭术及紫杉醇､铂类联合化疗后,依旧面临复发､转移及死亡的风险｡中药因具有不良反应小､疗效好等优点近年来被广泛用于癌症患者的临床治疗,中成药､中药注射液及中药复方在癌症的治疗过程中发挥了不可取代的优势作用,而中药单体作为以上中药的研究基础,具有靶点广泛､种类繁多､临床疗效·346·GUIZHOU YIYAO,2025,Vol.49,No.3好､毒副作用低及经济实用等优点,近年来越来越多的研究[4]表明中药单体可通过多种信号通路抑制恶性肿瘤生长､改善肿瘤微环境､抑制肿瘤侵袭和迁移､对抗肿瘤的多药耐药性等｡羽扇豆醇作为提取于中草药及食源性植物中的一种单体化合物,具有抗氧化､抗炎､促进伤口愈合及抗肿瘤等作用,对糖尿病､心脏病､关节炎､肝毒性损伤和肾毒性损伤均具有一定疗效,并且还具有保护神经､心脏､肝脏等作用[5],在抗肿瘤方面,羽扇豆醇可抑制肺癌､黑色素瘤､肝癌､结肠癌､胃癌､骨肉瘤､前列腺癌､胰腺癌等多种恶性肿瘤[2,6-10],研究[11-12]表明羽扇豆醇可通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)､Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)､Ras同源基因家族A(RashomologgenefamilymemberA,RhoA)-Rho激酶1(Rhoassociatedkinases1,ROCK1)等多种信号通路抑制肿瘤细胞增殖,王明等[13]发现羽扇豆醇在体外能有效地抑制人乳腺癌MDAMB-231细胞的侵袭和转移,刘博佳等[6]通过体内及体外实验均证实羽扇豆醇可抑制肝癌细胞的侵袭和迁移｡蒲公英等中药中可以有效提取出羽扇豆醇,有研究[1,8]表明蒲公英联合化疗药比单用化疗药治疗中晚期卵巢癌更能明显缩小癌灶,同时能增强患者的免疫力,且毒副作用小｡与其他恶性肿瘤一样,卵巢癌细胞的增殖､迁移和侵袭是卵巢癌进展的三个主要因素,首先出现癌细胞的无限制性增殖,然后癌细胞自原发肿瘤脱落并迁移进入血管,在循环系统中随血液到达远处并形成转移性肿瘤,本研究中MTT实验､细胞划痕实验及Transwell实验结果表明不同浓度羽扇豆醇处理后的人卵巢癌SKOV3细胞增殖､迁移和侵袭能力均明显下降,且对羽扇豆醇具有剂量依赖性,提示羽扇豆醇在体外实验中可显著降低人卵巢癌SKOV3细胞增殖､迁移和侵袭能力｡癌细胞增殖受到PCNA调节,PCNA增殖指数越高,癌细胞的分裂增殖效率越高,最终会让癌细胞获得无限增殖的能力,有研究[14-15]表明下调PCNA的表达水平可有效降低人卵巢癌SKOV3细胞的增殖活性,癌细胞的迁移和侵袭受ASAP1的调节,有研究证实ASAP1的过表达能够促进人卵巢癌SKOV3细胞的迁移和侵袭,促进癌细胞增殖和存活,并通过促进癌细胞的上皮—间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)过程,增强癌细胞运动和侵袭能力[16],而抑制ASAP1表达可有效降低癌细胞的侵袭能力[17]｡本研究Westernblot结果表明羽扇豆醇显著降低了人卵巢癌SKOV3细胞中PCNA和ASAP1的表达,且均对羽扇豆醇具有剂量依赖性,提示羽扇豆醇可能通过下调PCNA及ASAP1水平抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖､迁移和侵袭的能力｡这与本研究中MTT实验､细胞划痕实验及Transwell实验得出的结论相吻合｡综上所述,羽扇豆醇可明显抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖､迁移和侵袭能力,可能通过下调PCNA､ASAP1的表达来调控｡本研究存在一定局限性,本实验中羽扇豆醇对卵巢癌抑制作用的研究是基于人体外对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制反应,无法精准模拟出在人体内药物的反应过程,因而需要进行更多的动物实验研究,这也是本课题的后续研究方向｡利益冲突说明/ConflictofInterests所有作者声明不存在利益冲突｡伦理批准及知情同意/EthicsAPProvalandPatientConsent本研究通过江西省妇幼保健院医学伦理委员会批准,细胞机制研究不涉及知情同意｡

参考文献:

[1]刘红姣,许学兵.补阳还五汤合并蒲公英联合西药治疗卵巢癌的疗效及毒副反应影响[J].海峡药学,2018,30(11):2.

[2]韦燕飞,金丽杰,刘莎莎,等.羽扇豆醇抗肿瘤作用研究进展[J].中国药理学通报2021,37(7):897-901.

[4]申芳,徐佳越,刘芳媛,等.中药单体逆转卵巢癌顺铂耐药机制的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(3):226-233.

[5]韩泽平,蔡贞.羽扇豆醇对结直肠癌HCT116细胞的抑制作用及机制研究[J].国际检验医学杂志,2022,43(20):2433-2440.

[6]刘博佳,宁青,钟荣玲,等.羽扇豆醇对人肝癌细胞HepG2和SK-HEP-1侵袭､转移的影响及机制研究[J].中国中药杂志,2020:45(24):6028-6035.

[7]姜瑞,陈佳,侯向红.羽扇豆醇通过NF-κb信号通路调控胃癌小鼠免疫微环境[J].中国老年学杂志,2021,41(17):6.

基金资助:江西省中医药管理局科技计划项目(2022B983);

文章来源:邹亮,揭由坤,郭琦.羽扇豆醇对人卵巢癌SKOV3细胞增殖､迁移及侵袭的影响[J].贵州医药,2025,49(03):344-347+361.