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乳酸杆菌通过调控细胞自噬增强宫颈癌细胞放射敏感性

2025-04-26 54 上传者：管理员

摘要：目的探讨乳酸杆菌（Lactobacillus）对宫颈癌HeLa细胞增殖及放射敏感性的影响。方法体外培养宫颈癌HeLa细胞，采用四氮唑比色（MTT）法确定Lactobacillus和放射线对HeLa细胞的干预剂量；将宫颈癌HeLa细胞分为对照组、放射组、Lactobacillus组及Lactobacillus+放射组共4组，单丹磺酰（MDC）检测细胞自噬，免疫印迹检测Beclin1、LC3、P62的表达。结果随着MOI比例及放射剂量的增加，HeLa细胞抑制率增加，Lactobacillus对HeLa细胞的半数抑菌MOI为775.45±28.74，故选MOI=800作为干预浓度。放射线对HeLa细胞的半数抑菌剂量为（6.09±0.74）Gy，故选6Gy作为半干预剂量（P<0.05）。与6Gy放射组相比，随着MOI比例的增加Hela细胞存活率显著降低（P<0.05）。MDC结果显示，放射后细胞自噬显著增加。与对照组比较，Lactobacillus组细胞自噬相关蛋白Beclin1表达水平与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值显著下降，P62水平显著上升（P<0.05）；放射组Beclin1表达水平与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值较对照组显著升高，P62水平显著下降（P<0.05）。与放射组比较，Lactobacillus+放射组Beclin1表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显降低，P62水平显著上升（P<0.05）。结论Lactobacillus能抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，并抑制放射治疗诱导的HeLa细胞自噬，增加放射药物对HeLa细胞的敏感性。

关键词：
乳酸杆菌
宫颈癌
放射敏感性
粒体自噬
细胞自噬
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宫颈癌（Cervicalcarcinoma，CC）是一种严重威胁妇女健康的恶性肿瘤，是妇女死亡的主要原因之一［1］。报道表明，自噬与肿瘤的发展、发展密切相关［2-3］。王兴芬等［4］研究表明，自噬与血管内皮生长因子二者相互协同促进肿瘤的血管新生和细胞修复。且多项报道显示，自噬的抑制可以进一步降低放射药物治疗后肿瘤的发生，例如鼻咽癌［5］、肝癌［6］和大肠癌［7］。放射治疗是宫颈癌治疗的常用方法，通过宫颈内近距离放疗联合体外放疗可使患者临床受益增加［8］。有文献报道，体外放射治疗后，阴道中正常乳杆菌菌群数目显著增加，机体对常用抗生素的敏感性提高，即耐药性降低［9］。表明放疗可影响阴道菌群微生态。然而，关于阴道菌群对宫颈癌放疗敏感性的调节作用报道较少。本研究通过观察乳酸杆菌对细胞自噬的影响，探讨其在宫颈癌细胞放射敏感性中的应用，现报道如下。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1人CC细胞系Hela购自Procell生命科学与技术公司。

1.1.2主要试剂与仪器

乳酸杆菌（Lactobacillus，德氏乳杆菌DM8909）经阴道用乳杆菌活菌胶囊经MRS培养基培养。胎牛血清（HyClone，SH30084.03），DMEM培养基（伊势久生物）、青霉素-链霉素溶液（华北制药集团公司），GS抗体（Abcam）、LC3抗体（武汉赛维尔，GB11124），MDC染液（Solarbio，G0170）；X射线辐照仪（PXI，Con‐necticut，USA；源-面距：40cm）；Olympus荧光显微镜、电热恒温CO2细胞培养（Thermo公司），细菌培养摇床（哈东联电子技术开发公司），Nano‐Drop2000分光光度（ThermoScientif），蛋白印迹试验装置（美国Bio‐Rad公司），等。

1.2方法

1.2.1细胞培养

人CC细胞系Hela用基础培养基（MEM）辅以10%热灭活胎牛血清、1%青霉素‐链霉素溶液，并在37℃、体积分数为5%的CO2的培养箱中培养。每2~3d传代1次，本研究中的相关实验均选择处于对数生长期的细胞。

1.2.2Lactobacillus的浓度选择

将Hela细胞（5×103）接种于96孔板中，每个孔200个细胞，37℃、5%CO2的条件下进行培养。分别用感染复数（MOI）=0、200（细菌∶细胞=200∶1）、400、600、800、1000加入各孔或不同剂量放射线（0、2、4、6、8、10Gy），在细胞培养箱中共培养24h后向其中加入MTT（每孔50μL），继续培养4h，培养完成后以3000r/min的速度离心处理，丢弃上清液，向其中加入二甲基亚砜（DMSO），每孔200μL，置于振荡器中处理，处理完成后应用酶标仪（450nm）检测各吸光度值（A值），计算细胞的抑制率。细胞抑制率=A对照组-A处理组/A对照组×100%。

1.2.3细胞分组

将细胞随机分为对照组、Lacto‐bacillus组（MOI=800）、放射（6μg/ml）组和Lacto‐bacillus+放射（6μg/ml）组，对照组给予等量溶媒，其余组别按照分组分别给予Lactobacillus、放射线和Lactobacillus+放射线进行细胞处理，24h后进行相关指标的测定。

1.2.4单丹磺酰（MDC）检测

Hela细胞自噬MDC染色将对数生长期的Hela细胞在12孔板（1×105个/孔）中培养至≥60%融合，融合后选择6Gy的X射线进行照射（24h），照射完成后应用MDC检测自噬小体的形成。即先吸走培养基，再用PBS洗2次，然后在37℃的无血清的环境中，用MDC染色40min，用PBS进行反复冲洗直至洗涤干净，即刻在电子荧光显微镜下观察Hela细胞自噬的情况。

1.2.5蛋白免疫印迹法检测

Beclin1、LC3Ⅱ/LC3和P62的表达不同组别的细胞被清洗、收集和裂解。收集到的蛋白质选择10%~12%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS‐PAGE）进行分离，分离完成后转移置聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。应用5%脱脂奶进行阻断，时间为60min，阻断完成后选择GS抗体在4℃孵育12h，将小鼠抗GAP‐DH蛋白视作内参蛋白。之后对PVDF膜进行清洗，室温条件下培养60min。选择仪器显影得到的印迹，并通过ImageJ软件进行蛋白定量。

1.3统计学分析

采用SPSS26.0统计软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1Lactobacillus对Hela细胞抑制作用比较

随着MOI比例的增加，HeLa细胞的抑制率增加，与0μmol/L相比，差异有统计学意义（t值分别为43.443、60.550、62.038、66.523和60.909，P<0.05）；Lactobacillus对HeLa细胞的半数抑菌MOI为（775.45±28.74）μmol/L，故选MOI=800作为干预比例（图1）。

图1乳酸杆菌对Hela细胞抑制作用比较

2.2放射线对Hela细胞抑制作用的比较

随着放射线剂量的增加，HeLa细胞的抑制率亦增加，与0Gy相比，差异有统计学意义（t值分别为49.594、51.363、54.288、55.338、50.335，P<0.05）。放射线对HeLa细胞的半数抑制剂量为（6.09±0.74）Gy，故选6Gy作为干预剂量（图2）。

2.3Lactobacillus对Hela细胞放射敏感性的影响

与6Gy放射组相比，随着MOI比例的增加Hela细胞存活率显著降低（t=5.643，11.437，16.636，29.851，P<0.05）。Lactobacillus可以提高Hela细胞的放射敏感性（图3）。

图2放射线对Hela细胞抑制作用比较

图3Lactobacillus对放射抑制Hela细胞增殖的影响

2.4放射诱导Hela细胞自噬作用

6Gy剂量单次辐照后24h，MDC法观察Hela细胞在不同处理条件下的自噬形成情况，结果显示，放射后细胞自噬明显增加，提示自噬的激活，而Lactobacillus的参与进一步增加了自噬的数量（图4）。

2.5Lactobacillus对放射诱导HeLa细胞自噬的影响

与对照组相比，Lactobacillus组Beclin1水平与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值均显著下降，P62水平显著上升（t=12.754，22.417，33.826，P<0.05）；放射组Beclin1水平与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值显著升高，P62水平显著下降（t=17.178，24.352，36.615，P<0.05）。与放射组相比，Lactobacillus+放射组Beclin1水平与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值均显著下降，P62水平上升（t=27.562，38.803，46.619，P<0.05）（图5）。

图4Hela细胞自噬形成情况

图5Lactobacillus对放射诱导HeLa细胞自噬的影响

3、讨论

宫颈癌是威胁全球女性健康的重要疾病之一，报道显示，2020年全球范围内新发宫颈癌约为60.4万例，死亡为34.2万；而2020年，我国宫颈癌患者的新发病例接近11万例，死亡近6万例，给家庭、社会及经济均造成严重的负担［10‐11］。子宫切除加淋巴结清扫等手术是治疗宫颈癌的有效方法，但受宫颈癌教育普及情况及人们意识有影响，多数宫颈癌患者就诊时已为中晚期，错过了最佳手术时间，故对于此类患者根治性放疗成为其延续生命，提高生活质量的重要手段［12］。大量报道显示，自噬在恶性肿瘤细胞化放疗抵抗性形成的过程中起到关键作用，可帮助恶性肿瘤细胞躲避化放疗药物的杀伤性［13］。故抑制自噬有助于增强恶性肿瘤细胞对治疗药物的敏感性，增强药物疗效［14］。

Lactobacillus是阴道优势菌，研究发现乳酸杆菌能很好的粘附并抑制宫颈癌细胞的生长与繁殖［15‐16］。本研究发现，用不同MOI比的Lactoba‐cillus处理Hela细胞后，随着MOI比的上升，HeLa细胞的抑制率也显著增加，表明Lactobacillus能够发挥抑郁HeLa细胞增殖的作用。与此同时，研究发现，随着MOI比例的增加Hela细胞存活率显著降低（P<0.05），表明Lactobacillus可以提高Hela细胞的放射敏感性，同时Lactobacillus+放射组结果显示，二者联合后能显著增强放射药物对HeLa细胞增殖的抑制作用，并随着MOI的增加，抑制作用增强。

自噬可通过清除自身被损害的蛋白和细胞器维持机体代谢需要和内环境平衡。报道显示，自噬在恶性肿瘤细胞的形成、增殖中起到决定性作用［17］。自噬可通过抑制基因突变及恶性肿瘤基因的表达进而抑制肿瘤细胞的生长，在发病初期可通过吞噬作用控制病情发展；前期自噬主要是控制肿瘤病情，而在恶性肿瘤进展到后期时，自噬的作用则相反，其在晚期可为癌组织提供营养物质，为肿瘤细胞的繁殖创造良好的条件，同时还可能帮助正常细胞抵抗治疗药物的不良反应［18］。近年来，文献报道显示，萝卜硫素、沉默神经菌毛素-1、雷帕霉素可通过抑制恶性肿瘤细胞自噬增强放射治疗药物的敏感性［19-22］。本研究显示，放射组Be‐clin1蛋白表达增强，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平上升，且P62表达下降，表明放射治疗能诱导HeLa细胞的自噬。而Lactobacillus组结果则与放射组相反，Beclin1蛋白表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ上升，P62表达下降，同时Lactobacillus+放射组结果显示，Lactobacil‐lus能显著减弱放射药物对上述自噬相关蛋白的表达，表明Lactobacillus可对放射治疗诱导的HeLa细胞自噬发挥抑制效果。

综上所述，Lactobacillus能抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，并抑制放射治疗诱导的HeLa细胞自噬，增加放射药物对HeLa细胞的识别及杀伤能力。Lactobacillus联合放射药物可能有助于增强放射药物抗肿瘤作用，提示Lactobacillus可能是一种有效的放射增敏剂。

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