卵巢癌是女性生殖器常见三大恶性肿瘤之一，由于其早期症状不明显和位置隐秘，多数患者被确诊时已是晚期[1]。晚期的卵巢癌发生直接蔓延、淋巴结转移或腹腔种植，导致其5年生存率不足50%[2]。卵巢癌被认为化疗反应良好，但化疗后不良反应众多，多数患者出现化疗后不耐受，因此针对这部分患者而言，仍需探索更有效且不良反应小的其他替代药物[3]。

淫羊藿素是天然中药小檗科植物淫羊藿的有效成分之一，具有抑制肝癌[4]、肺癌[5]、乳腺癌[6]等癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用。淫羊藿素作为晚期肝癌候选药物阿可拉定的单一成分，已完成Ⅲ期临床试验[7]。课题组在前期研究淫羊藿素对卵巢癌细胞恶性行为影响时发现，淫羊藿素可以抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖并促进其凋亡[8]，但针对恶性程度更高的卵巢癌A2780细胞研究较少。A2780细胞，为未分化的人上皮性卵巢癌细胞，恶性程度高，侵袭性强，生长快，早期即可发生复发和远端的转移。上皮性卵巢癌细胞主要通过跨体外传播，利用经典的侵袭-转移级联机制，通过血行-淋巴管转运，在远处器官部位增殖形成微转移或大转移。这个过程成功与否主要取决于上皮间质转化（EMT）及其关键参与分子，包括E-钙黏蛋白（E-cadherin）和N-钙黏蛋白（N-cadherin)[9]。本实验研究淫羊藿素对卵巢癌细胞A2780增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响，以推导淫羊藿素的广谱抗癌作用，并探讨淫羊藿素通过调控EMT相关分子的表达抑制A2780细胞侵袭迁移。

1、材料

1.1细胞株

人上皮性卵巢癌细胞A2780购自上海芯超生物科技有限公司，编号HOva-A2780-01，传至第3代。

1.2药物及试剂

淫羊藿素（北京索莱宝科技有限公司，批号SI8020，纯度≥98%）；胎牛血清（FBS，重庆荣达普麦生物技术有限公司，批号04-001-1ACS);1640培养基（美国Gibco公司，批号8120320）；青霉素-链霉素溶液，0.25%胰酶（不含EDTA），结晶紫染液，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（中国上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为C0222,C0205,C0121,P0012A）；细胞增殖与活性检测（CCK-8）试剂盒（日本同仁公司，批号CK04);Annexin-V-FITC/碘化丙啶（PI）双染色法流式细胞检测试剂盒（美国Invitrogen公司，批号V13241）；二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司，批号D2650）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），波形蛋白（Vimentin），基质金属蛋白酶-9(MMP-9),E-cadherin兔多克隆抗体（美国SAB公司，批号分别为21612-2,33541-2,21677-2,40860-2);N-cadherin兔单克隆抗体（美国CST公司，批号131116）；二抗（山羊抗兔，美国SAB公司，批号L3012);SteadyPure通用型RNA提取试剂盒Ⅱ（艾科瑞生物科技有限公司，批号AG21022);TBGreen®PremixExTaqTMⅡ，PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser（日本Takara公司，批号分别为RR820A,RR047A）；基质胶（美国BD公司，批号356234）。

1.3仪器

NANODROP型2000微量核酸蛋白测定仪（美国BioTek公司）；SynergyHTX全型自动酶标仪，Form371型CO2细胞培养箱（美国ThermoFisherScientific公司）；BX53型倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）；OdysseyFc型双色红外荧光成像系统（美国Li-Cor公司）；MiniPROTEAN®TetraSystem型垂直电泳装置、湿转仪，CFX96型Touch实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-timePCR）仪（美国Bio-Rad公司）；CytoFLEX型流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）；iCEN-24R型低温高速离心机（杭州奥盛仪器有限公司）。

2、方法

2.1细胞培养及实验分组

将A2780细胞接种于含有6mL10%FBS的完全培养基中（每50mL培养基中加入10%胎牛血清，1%100U·mL-1青霉素，0.1g·L-1链霉素，89%1640培养基）于5%CO2,37℃恒温孵育箱中培养，3d后进行传代种板。根据课题组前期实验基础[8]，将A2780细胞分为空白组、淫羊藿素组（5,10,20μmol·L-1），取对数生长期的细胞进行药物干预，并在作用48h后进行检测。

2.2CCK-8检测细胞活性

取96孔板按实验分组分为4组，每组设置6个复孔，选取需要传代铺板的A2780细胞，计数并调整细胞密度为5×104个/mL，每孔加入细胞悬液100μL，孵育箱内培养24h。分组给药处理48h，在避光条件下，每孔加入CCK-8试剂液10μL，孵育箱内孵育3.5h，避光取出，仪器检测各组的吸光度A。重复3次以上，根据A计算增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（A空白组-A药物组）/A空白组×100%。

2.3流式细胞术检测细胞凋亡

选取呈对数生长期的A2780细胞接种于6孔板上，按照药物分组每组设置3个复孔，孵育箱内培养24h后按照药物分组给药，处理48h，用不含EDTA的0.25%胰酶消化后收集细胞。800r·min-1离心4min（离心半径6cm），重悬细胞。避光向离心管中加入Bindingbuffer100μL,Annexin-V-FITC和PI各2μL，混匀后室温静置5min。流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。重复3次以上，计算每组细胞凋亡率。

2.4划痕实验检测细胞横向迁移情况

取2个6孔板，用记号笔在孔板背面每隔0.5cm划一条横线，保证每个孔至少有3条横线穿过。将呈对数生长期的A2780细胞按照1.5×106个/孔接种于6孔板内，24h后观察细胞铺满整个孔板。将细胞分为空白组、淫羊藿素组，每组设置3个复孔。用1mL枪头靠着直尺垂直于背面横向划竖线，每孔3条竖线。取横竖线交点处于显微镜下拍照，记为0h。药物作用48h后，将6孔板从孵育箱内取出拍照，记为48h。采用ImageJ软件计算划痕面积，划痕愈合率=（S0h划痕面积-S48h划痕面积）/S0h划痕面积。

2.5transwell迁移实验检测各组细胞纵向迁移情况

取对数生长期细胞接种于12孔板内，分别为空白组和淫羊藿素组，每组3个复孔。孵育24h，按照不同组别加药，作用48h，取作用后的细胞用无血清的1640培养基分别配成2.5×105个/mL细胞悬液，将小室放入24孔板内，下室加入含20%FBS的培养基750μL，上室加入细胞悬液200μL，孵育箱内培养48h。移去培养基，PBS润洗2次，去除上室未迁移细胞，甲醛固定30min，移去甲醛，PBS润洗2次，结晶紫染液避光染色30min,PBS润洗2次，棉签擦干上室内未迁移细胞，光学显微镜下拍照。采用ImageJ软件自动计数细胞数量。

2.6transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭情况

细胞分组及加药培养同2.5项，作用48h。用不含血清的培养基按照1∶8的比例稀释基质胶，向小室内加入稀释后的基质胶100μL,37℃孵育箱内5h，待其成胶。取作用后的细胞用无血清的1640培养基分别配成2.5×105个/mL细胞悬液，下室加入含20%FBS的培养基750μL，上室加入细胞悬液200μL，孵育箱内培养48h。移去培养基及基质胶，PBS润洗2次，去除上室未侵袭细胞，甲醛固定30min,PBS润洗2次，结晶紫染液避光染色30min,PBS润洗2次，棉签擦干上室内未侵袭细胞，光学显微镜下拍照。运用ImageJ软件自动计数细胞数量。

2.7蛋白免疫印迹法（WesternBlot）检测EMT和肿瘤侵袭迁移相关蛋白表达

取对数生长期的A2780细胞接种于T75培养瓶内，孵育箱内培养24h，按照药物分组作用细胞48h，收集细胞，并向每管细胞中加入200μL裂解液，于冰上静置1h，期间每15min吹打100次。4℃，15000r·min-1离心15min，转移上清至新1.5mL离心管。按BCA法测定蛋白浓度，并配平。8%SDS-PAGE凝胶电泳，切胶、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h,TBST洗3次，加入N-cadherin,E-cadherin,MMP-9,Vimentin一抗（1︰1000),4℃孵育过夜。洗膜，孵二抗，TBST洗3次后发光拍照。ImageJ软件分析条带灰度值，GAPDH作为内参，计算各蛋白相对表达水平。

2.8Real-timePCR检测EMT和肿瘤侵袭迁移相关mRNA表达

细胞接种于6孔板中，培养24h后按分组用药干预48h，按照艾科瑞生物公司的通用型RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，仪器检测提取结果，观察是否存在污染，并确定各组RNA浓度，进行逆转录操作，反应条件：37℃，15min;85℃，5s;4℃保存，内参选取GAPDH，进行PCR扩增反应，反应条件：预变性95℃，1min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s；共设置39个循环，采用2-ΔΔCt法统计结果。引物序列由北京擎科新业生物技术有限公司合成。N-cadherin(229bp）：上游5'-AGGACAGCCTCTTCTCAATGT-3'，下游5'-TAAGGTTGGCTTCAGGCTCA-3';E-cadherin(153bp）：上游5'-TGCCTGAGAACGAGGCTAAC-3'，下游5'-TGCCATCGTTGTTCACTGGA-3';MMP-9(111bp）：上游5'-CAGTACCGAGAGAAAGCCTATT-3'，下游5'-CAGGATGTCATAGGTCACGTAG-3';Vimentin(178bp）：上游5'-GGACCAGCTAACCAACGACA-3'，下游5'-AAGGTCAAGACGTGCCAGAG-3';GAPDH(119bp）：上游5'-TCTGACTTCAACAGCGACACC-3'，下游5'-CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3'。

2.9统计学分析

使用SPSS25.0软件对实验所得数据进行统计，计量资料结果以表示。两组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

3、结果

3.1淫羊藿素对A2780细胞增殖的影响

与空白组比较，淫羊藿素各组细胞抑制率显著上升，差异具有统计学意义（P<0.01）。提示淫羊藿素可以抑制卵巢癌A2780细胞的增殖。见表1。

3.2淫羊藿素对A2780细胞凋亡的影响

与空白组比较，淫羊藿素高、中、低浓度组细胞总凋亡率均上升，其中以晚凋细胞变化最显著，差异具有统计学意义（P<0.01），说明淫羊藿素对A2780细胞凋亡的影响，主要集中在促进细胞的晚期凋亡。见表2。

3.3淫羊藿素对A2780细胞横向迁移的影响

与空白组比较，淫羊藿素各组的划痕愈合率和横向迁移水平均有下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3，图1。

3.4淫羊藿素对A2780细胞纵向迁移的影响

与空白组比较，淫羊藿素各组的细胞迁移数量和细胞迁移率显著减少（P<0.01）。见表4，图2。

3.5淫羊藿素对A2780细胞侵袭的影响

与空白组比较，淫羊藿素各组细胞侵袭数量和细胞侵袭率明显减少（P<0.05,P<0.01）。见表5，图2。

3.6淫羊藿素对A2780细胞相关蛋白表达的影响

与空白组比较，淫羊藿素各组中E-cadherin蛋白表达明显上升（P<0.05）；淫羊藿素20μmol·L-1组N-cadherin,MMP-9,Vimentin蛋白表达明显下降（P<0.05,P<0.01）。见图3，表6。

3.7淫羊藿素对A2780细胞EMT和肿瘤侵袭迁移相关mRNA表达的影响

与空白组比较，淫羊藿素20μmol·L-1组N-cadherin,MMP-9,VimentinmRNA表达显著降低，差异具有统计学意义（P<0.01）；淫羊藿素组E-cadherinmRNA表达显著升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。见表7。

4、讨论

卵巢癌是妇科常见肿瘤，被称为“沉默的杀手”，由于其起病隐匿，早期症状不明显，有接近70%的患者发展到Ⅲ，Ⅳ期时才被确诊[10]，且晚期的卵巢癌多数已发生远端的转移，临床上手术治疗和化疗难度较大，不良反应众多，预后不佳。A2780细胞作为未分化的癌细胞，是卵巢癌细胞中恶性程度最高的细胞系之一，具有侵袭性强，早期转移，复发率高，病情发展迅速，治疗难度大等特点。天然草本中药淫羊藿具有补肾阳强筋骨等作用，淫羊藿素是淫羊藿的黄酮类提取物[11]，根据体内外研究的数据表明，淫羊藿素对宫颈癌、乳腺癌、肝癌和肺癌等癌症具有抗癌活性，并通过促进肿瘤细胞的凋亡坏死、诱导细胞周期停滞、干预肿瘤相关信号通路、抑制肿瘤侵袭转移和增强自身免疫力等机制发挥抗肿瘤作用[12,13,14,15]。有研究表明，淫羊藿素可能通过激活相关信号通路对非小细胞肺癌A549细胞产生抗癌活性[16]。TAO等[17]发现，淫羊藿素抑制乳腺癌的恶性行为与雌激素受体有关，并提出在临床应用中应考虑淫羊藿素对雌激素的作用。卵巢癌与乳腺癌均为雌激素依赖性肿瘤，并且大量实验研究表明，淫羊藿素对于肿瘤细胞的恶性行为具有抑制作用，包括抑制增殖，促进凋亡等。

癌症的发展与癌细胞侵袭转移关系密切，控制癌症的侵袭转移可以提高患者生存率、延缓癌症进程、减少放化疗次数和改善患者生活质量。研究表明，MMP-9的表达与多种肿瘤的侵袭转移成正相关[18]。另外，EMT在促进肿瘤侵袭迁移中也扮演着重要角色[19]。上皮间质转化是上皮细胞转变为具有运动特性的间充质细胞的过程，在发育和伤口愈合中不可或缺，并在病理上促进纤维化和癌症进展[20]。EMT被定义为上皮性标志物E-cadherin的缺失和间质性标志物Vimentin,N-cadherin表达的上调[21]。李智慧等[22]发现通过抑制EMT的进程可以抑制肺癌细胞的转移和侵袭。另有学者研究发现EFEMP2通过上调或下调EMT标志物的表达影响膀胱癌的进展和转移[23]。EMT因此成为抗癌治疗的首要目标[24]。

本课题通过体外实验研究淫羊藿素干预人卵巢癌A2780细胞48h后增殖抑制和细胞凋亡情况。CCK-8结果表明，淫羊藿素高剂量组对卵巢癌细胞的增殖抑制率接近50%，流式细胞术显示淫羊藿素对卵巢癌细胞的促凋亡作用主要集中在晚期凋亡，并且随着浓度的增加凋亡率逐渐上升。本实验结果显示，与空白组比较，淫羊藿素能同时下调N-cadherin,Vimentin和MMP-9的表达，并上调上皮性标志物E-cadherin的表达。表明淫羊藿素对卵巢癌细胞A2780侵袭迁移的影响可能是通过EMT途径实现的。

综上，淫羊藿素对卵巢癌A2780细胞具有抑制增殖、促进凋亡，并可能通过EMT途径抑制其侵袭迁移。卵巢癌的临床手术治疗和放化疗方法已近乎成熟，而对于不能接受手术或放化疗的患者来说，保守治疗方面仍具有较大发展前景。目前国家政策提倡发展祖国医学，对于中医药的推广与研究十分有利，以天然产物为来源的新型治疗方法的研究正在不断进行与完善。本实验为卵巢癌临床保守治疗的新药开发提供实验基础。

文章来源：李秋瑞,侯科名,王猛,陈蓉.淫羊藿素对人卵巢癌A2780细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(20):101-107