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山慈菇多糖对人卵巢癌细胞增殖和上皮间质转化影响

2023-07-19 82 上传者：管理员

摘要：研究山慈菇多糖对卵巢癌细胞增殖和上皮间质转化(EMT)的影响及其作用机制。方法将OVCAR5细胞随机分为对照组(正常培养)、低剂量实验组(1.0 mg•mL-1的山慈菇多糖处理细胞)、中剂量实验组(2.0 mg•mL-1的山慈菇多糖处理细胞)、高剂量实验组(4.0 mg•mL-1的山慈菇多糖处理细胞)、高剂量+CP21组[1.0 mg•mL-1的山慈菇多糖+10 nmol•L-1的Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路激活剂CP21处理细胞]。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测各组细胞存活率；用蛋白质印迹法检测各组细胞相关蛋白表达水平；用Transwell实验检测各组细胞侵袭能力。结果对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+CP21组β-catenin蛋白水平分别为0.88±0.11、0.73±0.05、0.58±0.07、0.30±0.05、0.65±0.08;细胞克隆数分别为184.00±10.28、139.67±7.41、105.33±4.85、71.50±4.75、117.33±9.94;细胞核相关抗原Ki67(Ki67)蛋白表达水平分别为1.05±0.06、0.87±0.05、0.67±0.05、0.33±0.02、0.70±0.09;细胞侵袭细胞数分别为(151.00±8.16)、(123.33±4.75)、(95.50±5.28)、(61.83±9.06)、(108.33±5.71)个；上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达水平分别为0.35±0.03、0.58±0.07、0.79±0.03、1.04±0.07、0.70±0.04;N-钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达水平分别为0.98±0.07、0.77±0.09、0.53±0.03、0.38±0.05、0.78±0.08。以上指标，低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组与对照组比较，高剂量+CP21组与高剂量实验组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论山慈菇多糖可通过抑制Wnt/β-catenin通路抑制细胞增殖和EMT,减缓卵巢癌进展。

关键词：
Wnt/β-连环蛋白通路
上皮间质转化
卵巢癌
增殖
山慈菇多糖
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卵巢癌是一种影响女性生殖道的致命恶性肿瘤，在组织学上，大约90%的卵巢肿瘤被认为是通过上皮细胞的转化发生的，由于卵巢癌在早期通常无症状，大多数患者最终会进展到晚期，并导致高死亡率[1,2]。山慈菇多糖是中草药山慈菇的主要活性成分之一，具有显著的抗肿瘤作用[3]。研究报道，Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路参与卵巢癌细胞的增殖及迁移，介导Wnt/β-catenin信号通路可调控卵巢癌的发生和发展[4]。本研究通过体外培养卵巢癌细胞，探讨山慈菇多糖对卵巢癌细胞增殖和侵袭的作用及其作用机制。

材料与方法

1、材料

细胞人卵巢癌OVCAR5细胞，购自上海帛科生物技术有限公司。

药品与试剂山慈菇多糖，规格：500 mg,纯度：90%,批号：20221012,上海烜雅生物科技有限公司生产；CP21,规格：20 mg,纯度：98%,批号：20220922,武汉科斯坦生物科技有限公司生产。二甲基砜(dimethylsulfoxide, DMSO),购自济南世纪通达化工有限公司；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)购自北京杰辉博高生物技术有限公司；β-catenin、骨髓细胞瘤病毒癌基因(myelocytomoma virus oncogene, c-myc)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、细胞核相关抗原Ki67(nuclear associa-ted antigen Ki67, Ki67)、细胞周期蛋白1(cyclin D1)、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、蜗牛蛋白(Snail)、波形蛋白(Vimentin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、组蛋白H3样抗体(Histone H3)一抗，均购自英国Abcam公司；HRP标记的二抗，购自上海创赛科技有限公司；电化学发光法检测试剂盒，购自北京杰辉博高生物技术有限公司。

仪器DMi8显微镜，购自德国徕卡公司；xMark酶标仪，购自美国伯乐公司；Tanon-2500全自动数码凝胶成像分析系统，购自上海天能科技有限公司。

2、实验方法

2.1细胞培养[5]5]

OVCAR5细胞培养在10%胎牛血清的DMEM培养基中，并置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每天观察细胞生长情况，待细胞融合至85%～90%时进行消化传代。

2.2细胞处理与分组

收集OVCAR5细胞，用不同浓度(0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg·mL-1)的山慈菇多糖处理细胞，并用CCK-8实验检测细胞存活率筛选浓度。将OVCAR5细胞随机分为对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+CP21组。其中对照组细胞为正常培养的OVCAR5细胞，低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组细胞使用1.0、2.0、4.0 mg·mL-1的山慈菇多糖分别处理细胞24 h,高剂量+CP21组细胞使用4.0 mg·mL-1的山慈菇多糖及10 nmol·L-1的Wnt/β-catenin通路激活剂CP21(用DMSO试剂配制)处理细胞24 h。

2.3以CCK-8实验检测细胞存活率[6]6]

收集OVCAR5细胞，调整细胞密度为5×104 cell·mL-1,并接种于96孔板中，每孔接种100μL,在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h,然后按照2.2方法处理后，继续培养24 h后每孔加入10%的CCK-8试剂20μL(使用无血清的DMEM配制),在培养箱中继续培养4 h(避光),然后用酶标仪检测光密度值(波长设定为450 nm),并计算生存率。存活率(%)=(实验组光密度值-空白组光密度值)/(对照组光密度值-空白组光密度值)×100%。

2.4以蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞相关蛋白表达水平[7]7]

收集各组药物处理后的细胞，加入裂解液提取总蛋白，并使用二喹啉甲酸蛋白测定试剂盒定量。取蛋白样品40μg进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，结束后在80 V电压下进行转膜并室温封闭1 h(5%脱脂奶粉),然后加入稀释的β-catenin、c-myc、PCNA、Ki67、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin、GAPDH、Histone H3一抗(1∶1 000稀释);在4℃冰箱里培养过夜，次日使用TBST试剂洗膜后加入HRP标记的二抗试剂(1∶2 000),并在37℃条件下培养45 min,然后TBST洗膜后进行ECL化学发光显影，使用凝胶成像系统进行曝光和拍照，并进行灰度值分析。

2.5以平板克隆实验检测各组细胞菌落形成[8]8]

收集细胞，按照2.2中分组进行处理，用0.25%的胰蛋白酶消化后吹打成单个细胞，然后将细胞悬液接种到含有培养液10 mL的培养皿中(每皿接种50个细胞),并在37℃、5%CO2培养箱中继续培养10 d,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时结束培养，弃上清液后用磷酸盐缓冲液进行清洗，使用4%的甲醛试剂进行固定，15 min后使用1%的结晶紫溶液进行染色，20 min后清洗细胞后拍照并计数。

2.6以Transwell实验检测各组细胞迁移能力[9]9]

收集OVCAR5细胞并按照2.2中分组处理各组细胞，然后取1×105cell·mL-1细胞悬液100μL加入到Transwell小室的上室，取DMEM培养液500μL加入到Transwell小室的下室，培养48 h后使用多聚甲醛固定15 min,用0.5%结晶紫染色，2 h后使用显微镜进行观察并计数。

2.7以Transwell实验检测各组细胞侵袭能力[10]10]

取基质胶50μL,分别涂抹于Transwell小室的上室，并在室温下培养6 h形成凝胶状物质。收集OVCAR5细胞并按照2.2中分组处理各组细胞，取细胞悬液100μL加入上室，在Transwell小室的下室加入DMEM培养基(含10%胎牛血清)500μL,继续培养48 h后使用甲醛固定0.5 h,并用0.5%结晶紫染色，2 h后擦掉没有穿膜的细胞，使用显微镜观察细胞侵袭数。

3、统计学处理

所有数据均用SPSS 23.0软件进行分析。计量资料用x¯±s表示，2组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。

4、结果

1不同浓度的山慈菇多糖对卵巢癌细胞存活率的影响

由表1可见，与0 mg·mL-1组比较，1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg·mL-1的山慈菇多糖处理细胞后，细胞存活率均显著降低(均P<0.05),而0.5 mg·mL-1的山慈菇多糖对细胞存活率的抑制作用无显著变化(P>0.05)。由于1.0 mg·mL-1的山慈菇多糖处理细胞后，卵巢癌细胞存活率开始出现显著降低，因此后续实验山慈菇多糖的低、中、高剂量浓度分别选择为1.0、2.0、4.0 mg·mL-1。

表1细胞存活率的比较(x¯±s)

2山慈菇多糖对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响

对照组细胞正常培养；低、中、高剂量实验组细胞用1.0、2.0、4.0 mg·mL-1的山慈菇多糖处理；高剂量+CP21组细胞用1.0 mg·mL-1的山慈菇多糖+10 nmol·L-1 CP21处理。

低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组中核β-catenin和细胞c-myc蛋白表达水平与对照组比较均显著降低(均P<0.05);与低剂量实验组比较，中剂量实验组、高剂量实验组细胞中β-catenin和c-myc蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05);与中剂量实验组比较，高剂量实验组细胞中β-catenin和c-myc蛋白表达水平进一步显著降低(P<0.05);与高剂量实验组比较，高剂量+CP21组细胞β-catenin、c-myc蛋白表达水平均显著升高(均P<0.05),见表2。

3山慈菇多糖通过Wnt/β-catenin信号通路对细胞克隆数及增殖相关蛋白表达水平的影响

低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组细胞克隆数和PCNA、Ki67、CyclinD1蛋白表达水平与对照组比较均显著降低(均P<0.05),且低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组之间，细胞克隆数和PCNA、Ki67、CyclinD1蛋白表达水平差异均有统计学意义(均P<0.05);与高剂量实验组比较，高剂量+CP21组细胞克隆数和PCNA、Ki67、CyclinD1蛋白表达水平均显著增加(均P<0.05),见表3。

表2细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的比较(x¯±s)

表3细胞克隆数及增殖相关蛋白表达水平的比较(x¯±s)

表4细胞迁移和侵袭数目的比较(x¯±s)

4山慈菇多糖通过Wnt/β-catenin信号通路对卵巢癌迁移和侵袭的影响

低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组细胞迁移和侵袭数目与对照组比较，均呈剂量依赖性显著降低(均P<0.05);与高剂量实验组比较，高剂量+CP21组细胞迁移和侵袭数显著增加(P<0.05),见表4。

5山慈菇多糖通过Wnt/β-catenin信号通路对上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关蛋白表达的影响

与对照组比较，低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组细胞E-cadherin蛋白水平均呈剂量依赖性显著增加(P<0.05),而N-cadherin、Snail、Vimentin蛋白水平均呈剂量依赖性显著降低(P<0.05);与高剂量实验组比较，高剂量+CP21组细胞E-cadhe-rin水平显著降低(P<0.05),而N-cadherin、Snail、Vimentin蛋白水平均显著升高(P<0.05),见表5。

表5细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达水平的比较(x¯±s)

5、讨论

本研究发现，不同浓度的山慈菇多糖处理OVCAR5细胞后，细胞存活率显著降低，同时平板克隆实验及蛋白质印迹结果也发现山慈菇多糖呈剂量依赖性显著降低卵巢癌细胞克隆数及增殖相关蛋白PCNA、Ki67、CyclinD1的表达水平。PCNA、Ki67、CyclinD1均是细胞增殖的关键调控蛋白，在细胞增殖中均异常高表达，结果提示山慈菇多糖对卵巢癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，这与魏仁波等[11]研究结果相似。

本研究中，不同浓度的山慈菇多糖处理细胞后，可呈剂量依赖性上调E-cadherin蛋白水平，并下调N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达，提示山慈菇多糖可通过抑制EMT过程抑制卵巢癌进展。

β-catenin和c-myc是该通路的关键调控蛋白，当该通路被激活后，Wnt配体可与跨膜受体进行结合，并抑制GSK-3β的活性使得β-catenin不被降解，在细胞质中大量积累，并进入核内进而激活下游c-myc、CyclinD1等基因，从而诱导癌细胞的增殖[12,13]。本研究中发现，山慈菇多糖呈剂量依赖性降低核β-catenin及c-myc表达水平，推测山慈菇多糖可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥其抗癌作用。此外本研究通过Wnt/β-catenin信号通路激活剂CP21处理细胞后，发现CP21可显著削弱山慈菇多糖对卵巢癌细胞增殖、迁移和EMT的抑制作用，提示山慈菇多糖可通过Wnt/β-catenin通路发挥抑癌作用。

参考文献:

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