1983年，巴里·马歇尔和罗宾·沃伦在评估胃炎和消化性溃疡患者的胃黏膜组织时发现了幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)[1]。H.pylori是一种定植于人类胃上皮的革兰氏阴性、螺旋形、微需氧细菌，属于弯曲杆菌目螺旋杆菌科，尽管近10年来世界范围内的患病率有所降低，但仍有近50%的人口受到感染[2]。H.pylori感染与消化性溃疡、胃癌及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等疾病的发生发展具有相关性，而根除H.pylori的治疗可以降低上述疾病发生的风险[3]。近年来，由于不考虑细菌耐药性的经验性根除治疗在世界范围内的广泛使用，抗生素耐药性迅速显著上升[4],成为H.pylori治疗失败及根治率降低的主要原因[5]。最近的研究[6-7]表明，抗菌素敏感性试验指导的治疗可提高细菌根除率。而通过侵入性的内镜检查进行H.pylori的培养及抗生素敏感性试验非常耗时，且因其需要较为严格的温度、空气等环境条件，培养失败率可达20%[8]。H.pyloriDNA已在血液、粪便和口腔等许多临床标本中检测到[9]。利用非侵入性的粪便样本进行H.pylori感染的诊断及耐药性检测正逐渐成为一种有吸引力的替代方案。除了具有无创便捷、易于获得的优势外，针对粪便样本的分子检测还可以揭示出H.pylori抗菌药物的耐药特点，对临床指导治疗方案具有极大意义[10]。本文就基于粪便样本诊断H.pylori感染及检测其耐药情况的研究进展进行综述和分析。

1、粪便抗原检测(stool antigen test, SAT)

1.1 SAT的诊断效能及应用

SAT是一种基于抗原-抗体反应直接检测粪便中存在的H.pylori抗原的方法。不同SAT在诊断敏感性和特异性方面均有差异，这种差异可能与酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA)、免疫层析分析(immunochromatography analysis, ICA)或化学发光免疫测定(chemiluminescent immunoassay, CLIA)等测试的设计原理以及单克隆抗体和多克隆抗体的选择有关[11]。第一批开发的SAT使用多克隆抗体，但由于其在治疗后检测中产生了大量假阳性结果，目前多已被单克隆抗体取代[12]。为评估不同SAT的不同诊断性能，许多学者对多种SAT试剂盒展开了临床研究[13-15]。目前研究表明，单克隆EIA的诊断结果比单克隆ICA更为可靠[16-17]。除了提供H.pylori感染诊断的定性信息外，SAT可以为临床医师提供更多的信息，并且可以扩展其应用。Kakiuchi等[14]评估了名为Quick ChaserH.pylori(QCP)的H.pylori抗原检测试剂盒。不同于一般市面上靶向于H.pylori过氧化氢酶的试剂盒，QCP试剂盒靶向于H.pylori的鞭毛蛋白。他们将QCP与另一种粪便抗原检测试剂盒(testmate rapid pylori antigen, TRP)进行了比较，同时使用快速尿素酶检测和培养作为标准，发现QCP不仅对检测H.pylori感染具有很高的敏感性和特异性，并且对H.pylori标准菌株和克拉霉素耐药临床分离株的敏感性是TRP的8倍，对克拉霉素敏感的临床分离株的敏感性是TRP的4倍。

1.2 SAT的优势与局限

对于SAT,作为一种非侵入性诊断方式，其便捷、高效、费用低廉等特点使其格外适用于H.pylori感染的社区大规模筛查，尤其在儿童感染筛查方面有不可替代的优势。然而SAT在粪便采样及诊断性能方面的局限性也不可忽视。首先要注意粪便的形状和样本采集与检测的间隔。粪便抗原稀释或保存不当失活可能提供假阴性结果。SAT的阴性结果可能并不表明未感染H.pylori,因为细菌在胃中的低定植导致样本中H.pylori抗原浓度低，例如在严重萎缩性胃炎和肠化生患者，H.pylori定植减少，也可能导致假阴性结果[18]。此外，PPI、铋剂等药物及消化道出血等也是可能影响SAT诊断结果的因素[17]。相比目前应用广泛的13C-尿素呼气试验，SAT诊断的敏感性与特异性仍需要进一步验证。

2、分子检测

2.1聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)

PCR是一种广泛应用于生物学和医学研究中可靠的分子检测技术之一，在临床上广泛应用于细菌和病毒感染的诊断[19]。如今，几种基于PCR的商业检测试剂盒中常用的检测原理有实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)、巢式PCR(nested-PCR)和微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)等。其中巢式PCR涉及两轮扩增，能够以较低的浓度扩增靶序列，从而使其相比常规PCR具有更灵敏的特点[20]。

2.1.1 PCR的优势与局限：

相较于基于有创的侵入性内镜检查后进行H.pylori培养及药敏试验至少需要1～2周的时间来培养需氧菌，粪便样本PCR检测的时间成本非常低，这使得从诊断到进行个性化治疗的间隔时间更短。关于获得耐药性结果的时间间隔，巢式PCR从提取到完成分析需要6.5 h; AmplidiagH.pylori+ClariR PCR需要约225 min; 23S rRNA的实时荧光PCR仅需<2 h[21]。除了具有一般非侵入性检测手段的便捷、高效优势外，粪便样本PCR检测还可特异性地检测H.pylori抗生素的耐药性和毒力因子。PCR检测不仅具有高敏感性和特异性，它还可以同时检测H.pyloriDNA的存在和与抗生素耐药相关的基因突变，能够预测根除治疗的预后[22]。毒力因子对于临床医师评估H.pylori毒力及感染情况具有重要意义，利用粪便样本进行基于ddPCR的H.pylori检测可揭示个体细菌负荷变化与cagA毒力基因的存在之间的关系[23]。

同样，PCR检测在诊断性能方面也有其局限性，假阴性或假阳性的结果一定条件下不能全然避免。PCR不仅能靶向检测出活性细菌的DNA,其高度灵敏的特点使其对死亡细菌的DNA同样敏感，从而可能导致假阳性结果，这一局限性在诊断根除治疗以后的感染中尤为明显。此外，当H.pylori在体内外各种不利因素的作用下转变为球状体时，基于粪便样本的PCR检测的准确性将受到影响，从而可导致假阴性结果[24]。血红蛋白及其降解产物、多糖复合物、重金属和蛋白质等也可能影响PCR诊断感染的准确性[19]。

2.1.2基于粪便样本PCR检测克拉霉素耐药现状：

克拉霉素耐药率在亚太范围内的许多地区均有显著增加[25]。国内也有Meta分析表明，克拉霉素敏感病例的一线治疗根除率为90.11%,但克拉霉素耐药病例的根除率降至59.4%[26]。因此，克拉霉素不适合在抗生素耐药性高的地区经验性使用[27]。基于抗生素耐药性的个体化根除治疗可有效避免抗生素的不合理使用，达到良好的根除率[28]。而克拉霉素的遗传耐药与表型耐药具有较好的一致性，Vécsei等在一项回顾性研究中比较了基于粪便样本基因型检测和基于胃黏膜组织的耐药检测的根除疗效，76.0%的受试者感染被根除，两种样本类型之间的个体化根除疗效无差异[29]。故而可考虑以耐药基因突变检测替代H.pylori培养和抗生素敏感性测试，从而更加快速、方便、准确地获得克拉霉素的耐药信息，指导治疗方案的选择[30]。近年来，无创性获得粪便标本联合PCR检测耐药基因点突变的方式作为个体化治疗H.pylori感染的新方向已受到广泛关注。早在2008年就有Kawai等[31]基于对粪便样本进行的克拉霉素耐药性检测设计随机对照试验，对受试者进行了适当的个体化根除治疗，结果表明个体化组的ITT和PP根除率相同，均为94.3%,显著高于对照组的71.4%和78.2%。Giorgio等[19]用RT-PCR检测了52份H.pylori感染者的粪便样本和胃活检组织样本的克拉霉素耐药基因突变位点A2143G、A2142C和A2142G,结果显示，有10例(19.2%)为A2143G突变，有5例(9.6%)为A2142C突变，有4例(7.7%)为A2142G突变，结果表明粪便和胃活检组织样本检测结果一致。Beckman等[32]的研究发现，H.pylori的根除率可从克拉霉素敏感组的92%下降至克拉霉素耐药组的63%,他们收集了H.pylori患者的294份粪便样本，其中227份通过尿素呼气试验、食管胃十二指肠镜(esophagogastroduodenoscopy, EGD)检查及随后进行的组织学、培养和快速尿素酶检测(rapid urease detection, RUT)等多种诊断方式组成的复合参考法(composite reference method, CRM)和新型PCR检测均呈阳性。与CRM相比，PCR检测H.pylori感染的敏感性约为93.8%(95%CI:90%～96%)。而在213个具有可评估测序和PCR结果阳性的样本中，77个(36.2%)包含突变，136个(63.8%)包含野生型序列。包含突变的样本中，3份样本含有A2142C序列，19份样本含有A2142G序列，55份含有A2143G序列。Merrero Rolon等[22]有类似的发现，他们对524个粪便标本进行PCR检测，结果表明H.pylori阳性标本中检测到的克拉霉素耐药率为37%,高于美国当前文献中估计的比率，并且非常接近前文中Beckman等[32]报道的比率。与SAT相比，PCR检测对H.pylori感染诊断的敏感性为89%(101/114),特异性为97%(398/410),113个PCR阳性样本中包括了12例PCR阳性而SAT阴性的病例，这些病例实际上是抗原检测遗漏的真阳性病例。近年芬兰埃斯波开发了一种新的多重实时荧光定量PCR检测方法：AmplidiagH.pylori+ClariR,可检测H.pylori感染和克拉霉素耐药突变(不区分突变)。Pichon建立了一项前瞻性多中心研究[33],将对粪便样本进行AmplidiagH.pylori+ClariR检测的结果与对两个胃活检样本(来自胃窦和胃体)进行的培养和实时PCR结果进行比较，以检测H.pyloriglmM基因和赋予克拉霉素耐药性的23S rRNA基因突变。结果表明H.pylori检测的敏感性和特异性分别为96.3%(95%CI:92%～98%)和98.7%(95%CI:97%～99%),克拉霉素耐药性的敏感性和特异性分别为100%(95%CI:88%～100%)和98.4%(95%CI:94%～99%),体现出粪便样本PCR测定在检测H.pylori感染和克拉霉素耐药性方面具有非常高的性能。近日国内Ren等[21]进行了一项Meta分析，纳入16项研究以评价粪便样本中克拉霉素耐药基因型检测的诊断价值。结果表明粪便样本PCR检测对诊断H.pylori感染的敏感性为0.93(95%CI:0.88～0.96),特异性为0.98(95%CI:0.91～1.00),并且粪便标本PCR检测能有效诊断克拉霉素耐药。总的来说，基于粪便样本的PCR检测具有无创便捷、经济高效等特点，诊断敏感性和特异性也相当可观，值得期待作为侵入性药物敏感性测试的良好替代，以提供克拉霉素耐药性的准确信息和有效预测根治疗效。

2.1.3基于粪便样本PCR检测其他抗生素的耐药现状：

目前基于粪便样本PCR检测除克拉霉素以外抗生素耐药基因的研究发表相对较少。使喹诺酮类药物产生耐药性的主要突变位点位于H.pylori负责编码DNA旋转酶的gyrA基因的第87、91位和gyrB基因的第463位[34]。Brennan等[10]使用GenoType HelicoDR分别检测粪便样本与胃活检样本的H.pyloriDNA和gyrA基因耐药位点，结果发现胃活检样本检测H.pylori感染的准确性高于粪便样本[98.2%(54/55)vs80.3%(53/66),P<0.005],而与胃活检样本相比，粪便样本对耐药相关突变的检出率更高，在内镜检查呈阳性患者的活检样本中可检测到9.3%(5/54)存在喹诺酮类药物耐药突变位点，而来自UBT阳性患者的粪便样本中有13%(6/46)(95%CI:-9.99～18.28,P=0.56)的耐药突变位点被检出。编码RdxA和FrxA的基因大量突变是甲硝唑对H.pylori耐药目前报道较多的机制，而其耐药的产生更可能是由多种途径的累积效应引起的，因此到目前为止，暂无研究全面调查同一临床分离株中的这些机制[5]。由于甲硝唑耐药所涉及的基因突变更多样，其基因型-表型相关性也更为复杂[35],因此利用粪便样本设计PCR实验检测其耐药基因型对临床用药的指导意义有限。Losurdo等[36]进行了一项单中心研究，针对粪便样本利用RT-PCR分别检测阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星和四环素的PBP-1A、23S rRNA、RdxA/FrxA、gyrA和16S rRNA基因，耐药突变率分别为19.5%、29.2%、14.6%、31.7%和19.5%,根据耐药结果制定治疗方案后ITT和PP分析显示，根除成功率分别为90.2%(37/41)和92.3%(36/39)。目前尚缺少足够的大样本高质量研究证实粪便PCR检测阿莫西林、甲硝唑、左氧氟沙星、四环素等其他抗生素的基因耐药与其表型耐药的一致性。

2.2下一代基因测序(next generation gene sequencing, NGS)

NGS可以识别与抗生素耐药性相关的更复杂的遗传变异，能够以相对较低的成本对DNA和RNA进行大规模平行测序[37]。全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)是NGS技术在生物体全基因组测序中的应用之一，与PCR相比，它既可以基于靶基因上检测到的点突变来预测抗生素耐药性，也可以检测临床分离株中的新基因突变[38]。使用WGS检测新的耐药性相关突变不仅应用于克拉霉素和左氧氟沙星[39-40],还应用于甲硝唑[41]和阿莫西林[40, 42]。这对于发现抗生素耐药性的新潜在机制以及提供新的候选基因尤为重要，这些候选基因可比现有基因具有更好的基因组-表型相关性[35]。

在抗生素耐药性研究中，NGS有望成为胃组织活检培养及PCR检测的潜在替代方案。Moss等利用NGS研究了粪便样本在检测抗生素耐药性方面的准确性，发现从粪便样本中获得的结果与91.4%的从新鲜、冷冻或石蜡包埋的福尔马林固定胃活检样本中获得的结果一致，与92.2%的从新鲜胃标本中获得的结果一致，克拉霉素(k=0.94)、左氧氟沙星(k=0.88)和甲硝唑(k=0.89)的粪便和新鲜胃样本之间的耐药一致性良好[43]。然而，通过NGS检测到的基因耐药和表型耐药是否相关及NGS预测的耐药新基因型是否准确，仍旧需要覆盖范围更广、样本量更大或多中心设计进行研究。

3、总结与展望

粪便分子检测是检测H.pyloriDNA序列和抗生素耐药性点突变的可行工具。与组织学培养及抗菌药物敏感性实验相比，该技术是无创的，具有潜在的优势，如提高患者依从性、减少诊断程序时间、成本和改善治疗结果等[19]。已有学者利用基于粪便样本的PCR检测制定个体化根除治疗方案并取得可观疗效[31-32]。但基于粪便样本分子检测到的基因耐药与表型耐药的一致性，以及根据粪便分子检测的基因耐药结果制定个体化治疗方案的确切疗效等仍缺乏足够大范围、大样本、高质量的研究进一步证实。

基金资助:2022年度南京市卫生科技发展专项资金项目(YKK22116);

文章来源:瞿燚,张振玉.基于粪便样本检测幽门螺杆菌感染及耐药情况的研究进展[J].胃肠病学和肝病学杂志,2024,33(11):1552-1556.