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建立柯萨奇病毒A组6型TaqMan一步法实时荧光定量PCR方法研究

2020-06-16 298 上传者：管理员

摘要：目的：建立一种灵敏、特异的一步法实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR),用于快速、准确地检测柯萨奇病毒A组6型(CV-A6)。方法：利用MEGA7.0软件比对GenBank数据库中15条CV-A6VP1序列,选择高保守区域设计特异性引物和探针;以体外转录获得的RNA为标准品,绘制标准曲线,建立检测CVA6病毒的RT-qPCR方法;对该方法的灵敏度、特异度、重复性进行评估;并利用该方法对CV-A6病毒感染后的乳鼠组织进行病毒载量的检测。结果：该方法在102～1011copy/μL模板范围内出现良好的扩增曲线,检测极限约为102copy/μL,标准曲线中R2系数为0.999,扩增效率为109.6%;且该方法对肠道病毒71型(EVA71)、柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)和柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)均无交叉反应;另外,该方法在组间重复试验中,变异系数(CV)值小于2.0%。结论：本实验建立的方法具有较强的灵敏度、特异度和重复性,可用于CV-A6病毒的日常检测、实验室诊断和定量分析。

关键词：
TaqMan探针
临床检验
柯萨奇病毒A组6型
荧光定量聚合酶链反应
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自1998年以来，手足口病（HFMD）已成为全球重要的公共卫生问题[1]。与HFMD相关的病原体较为复杂，其中，以肠道病毒71型（EV-A71）和柯萨奇病毒A组16型（CV-A16）为主[2]。然而，从2008年起，与柯萨奇病毒A组6型（CV-A6）相关的HFMD病例在多个国家及我国许多地区被报道。并且，CV-A6病毒感染引起的HFMD具有非典型临床症状，主要表现为非典型疱疹、甲状腺肿、脱甲等，严重危害公众健康[3,4,5,6,7]。因此，CV-A6病毒得到了我国疾病预防控制部门和医疗卫生机构的充分重视，被纳入日常监测和临床检验中。传统检测病毒的方法有病毒分离、生化、血清学诊断等，这些方法虽然可靠，但检测周期长，操作复杂，不易快速得出结论。近年来发展起来的荧光定量聚合酶链反应（PCR），因其灵敏度、特异度、重复性好且操作简便快速，被广泛应用于病原体的定性定量检测[8]。

1、材料与方法

1.1标本

CV-A6(KYN-A1205、YN-A13）、EV-A71、CV-A16和CV-A10毒株由本实验室保存并提供，SPF级别实验动物BALB/c孕鼠由本单位的小动物实验部提供，实验动物操作经中国医学科学院医学生物学研究所动物伦理委员会批准（批准编号：DWSP201804001）。

1.2仪器与试剂

荧光定量PCR仪CFX96(BIO-RAD，美国）、病毒RNA提取试剂盒、病毒RNA扩增试剂盒、琼脂糖凝胶回收DNA试剂盒、加尾试剂盒、T载体、质粒DNA小量提取试剂盒、体外转录试剂盒、核酸稀释液、一步法实时荧光定量PCR试剂盒等。

1.3引物和探针设计

从GenBank数据库中下载15条CV-A6VP1基因序列，利用MEGA7.0软件比对后找出保守区域设计特异性引物（CV-A6-qP-F、CV-A6-qP-R）和Taqman探针（CV-A6-probe），利用NC-BI数据库中Primer-BLAST检测引物和探针的特异性。引物和探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其中，探针5′标记的荧光报告基团为FAM,3′标记的荧光淬灭基团为BHQ。

1.4阳性RNA标准品的建立

以本实验室分离并鉴定为CV-A6的毒株KYN-A1205（基因登录号：MN184853）作为模板，设计扩增引物CV-A6-VP1-F和CV-A6-VP1-R，其中上游引物包含T7启动子，且该对引物包含CV-A6-qP-F、CV-A6-qP-R引物及CV-A6-probe。采用病毒RNA扩增试剂盒进行RT-PCR反应，阳性PCR产物经琼脂糖凝胶试剂盒回收后利用DNA加尾试剂盒对其3′末端加“A尾”；与pMD18-TVector连接并转化DH5α感受态细胞，菌落PCR确定阳性克隆；利用质粒提取试剂盒提取质粒，送往硕擎（昆明）生物技术有限公司并用pMD18-TVector通用引物M13F和M13R测序确定目的片段插入的方向；SalI限制性内切酶将重组质粒线性化后切胶回收；体外转录试剂盒转录出目的RNA，并用紫外分光光度计测定其水平；根据公式计算拷贝数：单位体积RNA拷贝数（copy/mL)=6.02×1023×（Xg/mL）/（RNA碱基数×340),RNA于-20℃保存备用。其中，本实验所用到的引物和探针序列见表1。

表1引物和探针序列

1.5RT-qPCR方法的建立

反应体系（20μL):2×OneStepRT-PCRBufferⅢ缓冲液10μL,TaKaRaExTaqHS(5U/μL）为0.4μL,PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ为0.4μL,CV-A6-Probe(10μmol/L）为0.8μL,CV-A6-qP-F(10μmol/L）为0.4μL,CV-A6-qP-R(10μmol/L）为0.4μL,RNA模板为1μL,RNaseFreeH2O为6.6μL，其中引物和探针水平为试剂盒推荐的最佳浓度。按照说明书设置反应条件：42℃5min,95℃10s，另95℃5s,60℃30s共40个循环。

1.6灵敏度试验

根据上述RNA拷贝数计算公式，用核酸稀释液EASYDilution(forRealTimePCR）将RNA标准品稀释至初始浓度834ng/μL（对应拷贝数为1012copy/μL），连续10倍梯度稀释，从1011～100copy/μL，并设置无模板对照（NTC），按照上述反应体系及反应条件进行一步法RT-qPCR，从而确定检测最低拷贝数的极限。为了评估该标准品的重复性和稳定性，每个稀释度设置3个复孔。选取上述9个稀释度（103～1011copy/μL）对应拷贝数的对数和循环阈值Ct值，系统自动生成标准曲线。

1.7特异度试验

对EV-A71、CV-A16、CV-A6和CV-A10核酸进行检测以评估该方法的特异度。

1.8乳鼠组织病毒载量检测

毒株YN-A13感染1日龄BALB/c乳鼠后解剖取心、肝、脾、肺、肾、肠、脑组织并提取RNA，按照上述反应体系及反应条件进行一步法RT-qPCR，反应结束后根据Ct值和标准曲线公式计算出各组织中的病毒载量。

2、结果

2.1阳性RNA标准品的建立

经RNA拷贝数公式计算得出，当RNA标准品稀释至初始浓度为834ng/μL时，其对应拷贝数为1012copy/μL(RNA标准品长度为1477nt）。

2.2实验的灵敏度

经检测，RNA标准品在102～1011copy/μL范围内出现良好的扩增曲线，见图1A。当模板为102copy/μL时，Ct值为35.8，从而认为该方法的检测极限约为102copy/μL。RNA标准品在103～1011copy/μL的范围内具有良好的线性关系，见图1B(R2系数为0.999，扩增效率为109.6%，方程式为Y=-3.112X+43.149）。

图1不同稀释度的扩增曲线

2.3重复性试验

在本研究中，对102～1011copy/μL范围内的9个稀释度的样品各进行3次组内重复性试验，并对试验结果进行统计分析。利用软件SPSS19.0计算出组内荧光定量中Ct值及R2的值的变异系数（CV），见表2。

表2RT-qPCR组内重复性试验

2.4特异度试验

利用该方法检测EV-A71、CV-A16、CV-A6和CV-A10病毒核酸时，仅有CV-A6出现阳性扩增曲线，其余病毒及NTC检测结果均为阴性，见图2。

图2RT-qPCR的特异度试验

2.5乳鼠组织病毒载量检测结果

用该方法检测YN-A13毒株感染1日龄BALB/c乳鼠后各组织中CV-A6的载量。其中，各样本均出现良好的扩增曲线见图3A。Ct值在18.98～34.46，根据各样本达到荧光阈值对应的Ct值和标准曲线的公式可精确计算出各组织中CV-A6病毒的载量，见图3B。

图3乳鼠组织病毒载量检测结果

3、讨论

CV-A6为单股正链的小RNA病毒，作为近十年来引起HFMD的主要病原体之一，严重危害儿童的健康[9]。CV-A6感染可引起全身性水疱疹、侵蚀性皮疹和紫癜损伤等非典型HFMD临床症状，部分CV-A6感染可导致无菌性脑膜炎和脑干脑炎等严重疾病[10,11]。而且CV-A6感染容易与其他出疹性疾病，如水痘、麻疹等混淆，致使临床医生发生漏诊甚至误诊的情况。因此，建立一种快速准确检测CV-A6感染的方法，为CV-A6的流行病学调查和实验室诊断均提供了可靠的检测技术。

传统检测CV-A6的方法以病毒分离培养和血清学诊断为主[12]。病毒分离作为病毒性疾病诊断的金标准，常采用细胞培养对临床样品进行病毒分离。虽然，该方法特异度强，但培养周期过长，分离率低，因而，常被用于回顾性诊断。血清学诊断技术也伴有周期长和灵敏度低等缺点。另外，目前实验室常用的普通RT-PCR特异度虽强，但易污染且只能进行定性分析[13]。

CV-A6病毒与其他肠道病毒结构类似，其中VP1基因相对保守，常被用作病毒血清型鉴定以及进化分析的靶基因。本研究选择CV-A6的VP1基因比对后的保守区域设计引物和探针，构建一步法RT-qPCR检测方法，为进一步提高引物和探针与靶基因结合位点的保守性。另外，TaqMan探针与模板特异度互补，极大提高了反应的特异度。利用该方法检测EV-A71、CV-A16、CV-A6和CV-A10病毒核酸时，仅有CV-A6核酸出现扩增曲线，进一步提示该方法具有较强的特异度。经检测，该方法在102～1011copy/μL模板范围内，均具有良好的扩增曲线，提示该方法在很大的线性范围内可对病毒核酸进行检测和定量分析。再者，通过对该方法的重复性进行分析发现，组内CV值在0.20%～1.01%，小于2.00%，说明其重复性良好[14]。利用该方法检测感染CV-A6后BALB/c乳鼠组织的病毒载量，发现各样本均出现良好的扩增曲线，根据Ct值和标准曲线的公式可精确计算出各组织中初始病毒量。

另外，与李洋等[15]建立的CV-A6TaqMan探针RT-qPCR检测方法不同的是，本研究将构建好的重组质粒进一步线性化，并通过体外转录获得RNA为标准品。在检测反应体系中，RNA标准品与待检测的样品同步进行，一步法完成逆转录及qPCR的过程，保证了每个样品的扩增效率一致，对病毒进行定量时也尽可能地降低了试验误差。并且，在1h内可以同步完成96孔样品的扩增及检测，RT-qPCR产物无需凝胶电泳检测和测序分析，极大地节约了时间和成本。当然，该检测方法也存在一些不足，例如无法检测扩增片段的大小以及各个实验室构建的标准品有所不同导致实验结果缺乏可比性，但相信随着科技的发展，这些问题终将被突破。

4、结论

本研究成功构建了用于检测CV-A6并能对病毒精准定量的方法，为CV-A6的流行病学调查和预防带来了帮助。本检测方法特异度强，灵敏度高，重复性好，能够可靠地应用于CV-A6的检测。

参考文献：

[8]王楷宬,王素春,朱琳,等.禽流感病毒实时荧光定量RTPCR检测方法的建立[J].中国动物检疫,2019,36(4):64-69.

[12]代海丽,高铁磊,朱琳,等.柯萨奇病毒B3的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中国卫生检验杂志,2012,22(1):8-10.

[13]胡晓星,彭杰,冯悦,等.以主要流行EV71VP1基因高度保守区为靶点的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立[J].生命科学研究,2016,20(3):189-195.

[14]蔡丽娟,陈瑶,杜红延,等.柯萨奇病毒A组16型TaqMan一步法荧光定量RT-PCR快速检测方法的建立[J].广东医学,2012,33(5):598-600.

[15]李洋,张相萍,翟明强,等.柯萨奇病毒A6TaqMan探针实时荧光逆转录PCR检测方法的建立[J].中国病原生物学杂志,2015,10(11):971-975.

刘红波,丛山日,许丹菡,黄小琴,孙浩,杨昭庆,马绍辉.柯萨奇病毒A组6型TaqMan一步法实时荧光定量PCR方法的建立[J].国际检验医学杂志,2020,41(11):1314-1317.

基金:云南省科技计划项目(2017FA006).