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酶免联合核酸检测技术对无偿献血人群检测结果分析

2021-05-29 170 上传者：管理员

摘要：目的通过酶联免疫吸附试验（酶免）联合核酸检测技术对岳阳地区近4年无偿献血人群检测结果进行统计分析，评估核酸检测技术能有效降低输血相关感染风险，保障临床用血安全。方法对岳阳地区2016-2019年177052例无偿献血者的血液先进行酶免检测，对其中174471例无反应性血液标本再进行核酸检测，并对结果进行分析。对岳阳地区2016-2019年无偿献血者谷丙转氨酶（ALT）、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、抗-丙型肝炎病毒（抗-HCV）、抗-人类免疫缺陷病毒（抗-HIV）、抗-梅毒螺旋体（抗-TP）各项血液检测项目按年度进行分类并进行统计学分析。结果在岳阳地区采供血总量逐年递增的情况下，2016-2019年无偿献血酶免检测177052例，检出总阳性率为3.00%。岳阳地区无偿献血人群酶免检测阳性率较高的是ALT和HBsAg两项，总阳性率达到了1.54%和0.64%。岳阳地区2016-2019年无偿献血者ALT、HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP各项血液检测项目除抗-HIV无统计学意义（P>0.05）外，其余4项均有统计学意义（P<0.05）；而核酸检测174471例，检出HBV/HCV/HIV总阳性率为0.05%，低于其他实验室阳性率，核酸检测不同年度比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论核酸技术的应用最大限度地防止了经血液传播疾病，保障临床用血的安全。

关键词：
核酸检测
血液安全
血液筛查
输血风险
酶联免疫吸附试验测定
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《中华人民共和国献血法》的立法宗旨是“保证医疗临床用血需要和安全，保障献血者和用血者的身体健康，发扬人道主义精神，促进社会主义物质文明和精神文明建设。”[1]自该法颁布以来，岳阳市中心血站经过多方努力，严格按照相关法律法规做好献血前的征询工作，并采用灵敏、快速和严格的献血前初筛试验。我国于2015年印发《关于做好血站核酸检测工作的通知》，本站于2014年10月全面实施核酸检测项目（NAT)[2,3,4]，并于2015年开始全覆盖无偿献血者样本，有效地控制了经输血传播疾病。在保证血液安全的同时，通过建立无偿献血宣传长效机制，做到献血宣传“五进”工作，即进机关、进校园、进社区、进村组、进企业的工作做法，使本站2016-2019年采供血量逐年以10%左右递增，保证了岳阳地区临床用血安全、及时、有效的供应。本文通过对岳阳地区2016-2019年无偿献血者酶联免疫吸附试验（酶免）检测和核酸检测阳性结果进行统计学分析，了解核酸检测技术能否有效地缩短病毒检测的“窗口期”，大幅度降低临床用血感染病毒风险，进一步保障临床用血的安全。现将具体分析结果报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

2016-2019年岳阳市中心血站无偿献血者相关资料按照年度献血人数、检测方法和检测项目进行结果统计。

1.2仪器与试剂

AE288和AE200全自动酶标仪（深圳爱康公司），卓越1200生化仪（上海科华生物工程股份有限公司），MicralabSTAR全自动加样仪（瑞士哈密顿公司），核酸扩增荧光检测仪（美国ABI公司），高速冷冻离心机（湘仪公司）。酶免检测用试剂：谷丙转氨酶（ALT）检测试剂（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）检测试剂[北京万泰生物药业股份有限公司和英科新创（厦门）科技有限公司]，抗-丙型肝炎病毒（抗-HCV）检测试剂[上海科华生物工程股份有限公司和英科新创（厦门）科技有限公司]，抗-人类免疫缺陷病毒（抗-HIV）检测试剂[北京万泰生物药业股份有限公司和英科新创（厦门）科技有限公司]，抗-梅毒螺旋体（抗-TP）检测试剂[英科新创（厦门）科技有限公司和上海科华生物工程股份有限公司]。核酸检测用试剂：乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒/人类免疫缺陷病毒（HBV/HCV/HIV）核酸联合检测试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司）。以上所用试剂符合国家批准检定合格试剂，均在有效期内使用。

1.3方法

1.3.1ALT检测方法

利用标本中的ALT催化L-丙氨酸和α-酮戊二酸，生成丙酮酸和L-谷氨酸。底物L-丙氨酸与α-酮戊二酸在ALT作用下生成丙酮酸，生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶（LDH）作用下转化成L-乳酸，同时伴随着NADH的氧化，在波长340nm处吸光度下降，下降速率与血清中ALT活力成正比。结果判定：在37℃时的ALT正常值在50U/L及以下；大于50U/L判定为ALT检测不合格。

1.3.2HBsAg酶免检测方法

采用双抗体夹心法酶免原理，在微孔条上预包被纯化HBV表面抗体，配以酶标记抗体及TMB显色剂等其他试剂，检测人血清或血浆中的HBsAg。结果判定：每孔加50μL终止液，10min内经设定波长450nm/600～650nm的酶标仪进行比色。S/CO<0.7为阴性结果，S/CO>0.7为阳性结果。

1.3.3HCV抗体酶免检测方法

采用双抗原夹心酶免原理，用基因重组表达的HCV抗体包被酶联板，加入待测样本，再加入以长臂生物素标记修饰的HCV抗原，温浴规定时间后，样本中HCV抗体与包被抗原和生物素标记抗原形成复合物，再与链霉亲和素标记辣根过氧化物酶反应，经酶底物显色，以显色与否判断样本中是否存在HCV抗体。结果判定：每孔加50μL终止液，10min内经设定波长450nm/600～650nm的酶标仪进行比色。S/CO<0.7为阴性结果，S/CO>0.7为阳性结果。

1.3.4HIV抗体酶免检测方法

通过酶免进行人类血清或血浆的HIV-1P24抗原（双抗体夹心法）和HIV抗体（双抗原夹心法）的检测。采用抗P24单克隆抗体和HIV基因重组抗原制作预包被板，配以生物素标记P24抗体，以及辣根过氧化物酶标记亲和素、辣根过氧化物酶标记HIV重组抗原。当待测样本中存在HIV-1P24抗原时，在反应的过程中形成“固相HIVP24抗体-P24抗原-生物素标记的P24抗体-亲和素-辣根过氧化物酶”的免疫复合物，加入底物后形成显色反应；当待检标本中存在HIV抗体时，在反应过程中形成“固相HIV抗原-HIV抗体-酶标记HIV抗原”的免疫复合物，加入底物后形成显色反应。结果判定：每孔加50μL终止液，10min内经设定波长450nm/600～650nm的酶标仪进行比色。S/CO<0.7为阴性结果，S/CO>0.7为阳性结果。

1.3.5抗-TP酶免检测方法

通过TP抗原包被反应板，用TP抗原包被辣根过氧化物酶，应用双抗原夹心法原理，检测人血清或血浆中的TP抗体。结果判定：每孔加50μL终止液，10min内经设定波长450nm/600～650nm的酶标仪进行比色。S/CO<0.7为阴性结果，S/CO>0.7为阳性结果。

1.3.6核酸项目检测方法

经过酶免4项方法检测为阴性结果和ALT<50U/L的标本，再进行核酸项目检测。核酸项目主要包括3个步骤：样品制备（分离获取病毒核酸）、RNA逆转录成cDNA、cDNA的PCR扩增及特异性荧光探针的检测。检测过程中，首先通过汇集和单检得到一定数量的反应管样本，再在各反应管中加入裂解液，使病毒颗粒裂解并释放出核酸，混合物经孵育后其中的核酸结合于磁珠表面，经磁分离和洗脱，吸附于磁珠的核酸被释放到洗脱液中作为PCR反应的模板。模板加入PCR反应液中，逆转录和PCR扩增在同一管中高效进行，为一步法RT-PCR体系。扩增过程以cDNA作为扩增模板，通过荧光TaqManPCR的核酸扩增方法实现目标核酸片断的扩增，仪器于不同波长区独立检测靶基因和内标基因，最后系统通过累积荧光信号自动分析结果。结果判定：在ABI7500客户端软件Analysis标签的AmplificationPlot项中，PlotType框默认为ΔRnvs.Cycle,GraphType框默认为Log,Color框默认为Well,Options区Target框默认为All。更改结果判断选项，GraphType框设为Linear,Options区Target框分别设为FAM、VIC观察各项目扩增结果。Ct<50且FAM曲线高于阈值线则判为阳性；Ct≥50或无数值，且内标Ct<50,FAM曲线低于阈值线则判为阴性。若Ct≥50，但FAM曲线有显著上升趋势，应对该标本进行复试，如果复试结果为阳性，则该标本判为阳性；如果复试结果为阴性，则系统对该标本自动判为阴性。

1.4统计学处理

采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，数据阳性率比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.12016-2019年岳阳地区无偿献血者血液酶免检测技术检测结果

岳阳地区2016-2019年无偿献血者ALT、HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP各项血液检测项目除抗-HIV无统计学意义（P>0.05）外，其余4项均有统计学意义（P<0.05），见表1。

表12016-2019年岳阳地区无偿献血者血液酶免检测技术检测结果

2.22016-2019年岳阳地区无偿献血者血液NAT检测结果

岳阳地区2016-2019年无偿献血者HBV/HCV/HIV核酸联合检测4年NAT不合格率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。

表22016-2019年岳阳地区无偿献血者血液NAT检测结果

3、讨论

根据表1统计数据显示，岳阳地区2016-2019年无偿献血人数呈逐年递增趋势，年度血液检测阳性率由高到低为ALT、HBsAg、抗-HCV、抗-TP、抗-HIV，该阳性率与其他地区基本一致[1,5,6],HBV感染是该地区输血传播疾病的主要残余风险。分年度统计比较除抗-HIV无统计学意义（P>0.05）外，其他4项均有统计学意义（P<0.05）。2017年出现总阳性率升高，分析升高原因可能与献血前筛查力度不够有关。

根据表2统计数据显示，对2016-2019年岳阳地区无偿献血者标本177052例进行了酶免检测后，对无反应性标本174471例再进行核酸检测，阳性结果达到0.05%，年度之间比较差异无统计学意义（P>0.05），此结果低于衡阳市的0.278%、九江地区的0.197%和佛山的0.250%[7,8,9]，这种情况的出现与本实验室的检测方法ALT和酶免检测阴性结果再进行核酸检测，不进行平行检测有关[10]。2016-2019年核酸检测有反应性93例中HBVDNA93例，其他两项未发现有反应性标本，以上结果可以看出有两部分HBV酶免无法检测出来，一是HBV浓度低无法检出；二是正处于病毒感染“窗口期”和隐匿性感染肝炎病毒，但是核酸检测技术正好能够对这部分漏检HBV进行筛查。说明核酸技术能够有效缩短病毒检测“窗口期”，是一项血液筛查的有效补充试验。以上结论显示HBV感染是岳阳地区主要输血传播疾病的主要残余风险，这与酶免检测HBV阳性结果率0.64%为4个检测项目最高的结论一致，为主要输血传播疾病。

综上所述，输血安全是血液工作者永远面临的挑战，经血液传播疾病的“窗口期”又是这个挑战中的难点，解决难点当务之急就是如何有效地缩短“窗口期”，能够有效地缩短血液检测项目的“窗口期”[11,12]，对酶免方法漏检的具有感染性的标本，核酸检测方法能够检测出来，而酶免联合核酸检测技术的运用[13]相当于构筑了两道牢固的血液安全屏障，最大限度地防止了传染病经血传播，确保临床用血安全。

参考文献：

[1]邓雪莲,安万新,梁晓华,等.大连市血液中心血清学检测与核酸检测并行的效果观察[J].中国输血杂志,2012,25(1):38-40.

[2]石庆秋,罗必泰,谢家日,等.血液病毒核酸集中化检测的实践和体会[J].实验与检验医学,2018,36(2):279-281.

[3]方奎明,孙昂,吴晓晋,等.血液核酸检测降低经血传播疾病风险的研究[J].实用预防医学,2016,23(10):1188-1190.

[4]莫锦政,谢敬文,马伟文,等.核酸检测技术在献血者HBsAg筛查中的意义[J].实用中西医结合临床,2015,15(6):61-62.

[5]林诗雅,王淏,李仲平,等.2016年广州地区无偿献血者核酸和ELISA检测结果分析[J].临床输血与检验,2017,19(2):137-141.

[6]闫玉刚,杨立辉,丁静,等.核酸检测与酶免检测在宁夏地区无偿献血者血液筛查中的应用[J].现代养生(下半月版),2017(4):32-35.

[7]严凤好,钟展华,李雪群,等.HBsAg､抗-HCV､抗-HIV酶免阴性及单试剂反应性献血者核酸检测结果分析[J].临床输血与检验,2017,19(4):379-381.

[8]王湘屏,郭建波,段荣,等.衡阳地区无偿献血者核酸检测结果分析[J].临床输血与检验,2019,21(6):563-565.

[9]林俊填,刘知华,何其通,等.佛山地区无偿献血人群酶免联合核酸检测结果分析[J].临床输血与检验,2019,21(6):569-571.

[10]邱筱椿,王玲玲.上饶地区开展血液核酸筛查应用情况[J].实验与检验医学,2018,36(2):285-287.

[11]杜荣松,郑优荣,王淏,等.无偿献血者血液筛查不合格原因分析[J].现代医院,2018,18(4):485-487.