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shRNA-p53对人肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖及p125表达的影响
摘要：目的 研究p53对p125表达的影响,及其对人肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖的影响。方法 用脂质体转染技术,将实验分为3组:对照组(转染空载体pGPU6/GFP/neo-shNC的7721-shNC细胞)、空白组(肝癌细胞SMMC-7721)、实验组(转染p53重组真核表达质粒pGPU6/GFP/neo-p53-shRNA的7721-p53-shRNA细胞)。用蛋白免疫印迹法(WesternBlotting)检测p53和p125蛋白表达水平,用实时荧光聚合酶链反应检测DNA聚合酶δ催化亚基基因1(POLD1)、视网膜母细胞瘤蛋白1(Rb1)、转录因子E2F、细胞周期依赖性蛋白激酶2(CDK2)及细胞周期素E(CylinE)基因的表达水平。结果 实验组、对照组和空白组的p53蛋白表达水平分别为0.22±0.03,0.55±0.07和0.53±0.06,p125蛋白分别为2.86±0.21,2.20±0.28和2.24±0.25,POLD1mRNA分别为1.09±0.13,0.45±0.07和1.00±0,Rb1mRNA分别为4.16±0.29,1.10±0.16和1.00±0,转录因子E2FmRNA分别为2.49±0.12,1.08±0.17和1.00±0,CDK2mRNA分别为1.65±0.08,1.12±0.22和1.00±0,CyclinEmRNA分别为2.78±0.23,1.17±0.31和1.00±0,实验组的上述指标与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 通过RNA干扰技术反向验证了p53对p125表达的调控作用,其对肝癌细胞增殖具有抑制作用,可能是通过调控Rb1、转录因子E2F、CDK2和CyclinE等细胞周期因子基因表达而实现的。
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DNA聚合酶δ(polδ)是B-家族复制性聚合酶中的一种,在DNA复制、修复、重组及细胞周期调控中均起到重要作用[1,2]。p125是polδ的催化亚基,DNA聚合酶δ催化亚基基因1(POLD1)则是p125的编码基因。在人肝癌组织中POLD1基因表达水平显著高于癌旁组织,相应p125的表达也明显增强[3]。抑癌基因p53可以通过与转录因子Sp1竞争结合位点,进而抑制POLD1的活性[4]。本研究通过RNA干扰p53表达,从侧面验证p53对p125表达的影响,及其对肝癌细胞增殖的抑制作用。
材料与方法
1、材料
细胞人肝癌细胞SMMC-7721,购自中科院上海细胞库。
试剂脂质体Lipofectin-2000、Trizol试剂,均由美国Invitrogen公司生产;RNA干扰所用的siRNA序列,pGPU6/GFP/neo重组真核表达质粒(含有增强型绿色荧光蛋白阅读框,正确插入目的基因cDNA后,能够将目的蛋白融合在EGFP的C端)及阴性对照真核表达质粒pGPU6/GFP/neo-shNC,均由上海吉玛公司生产;SYBRGreenqPCRKit,天根(北京)公司生产;小鼠抗人p53单克隆抗体,山羊抗人DNA聚合酶δ(p125)多克隆抗体,美国SantaCruz公司生产;适配Odyssey系统远红外标记二抗-DyLight680/DyLight800,中杉金桥生物技术产品生产。
仪器7000实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)仪,美国ABI公司产品;MultiskanFC酶标仪,美国ThermoScientific公司产品;Odyssey远红外扫描仪,美国LICOR公司产品;IX70倒置相差显微镜,日本Olympus公司产品。
2、实验方法
2.1细胞培养
参照李燕等[5]的方法,将人肝癌细胞SMMC-7721置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,并置于37℃含5%CO2的温箱培养。
2.2细胞分组与处置方法
将实验分为空白组、对照组和实验组。空白组为正常肝癌细胞SMMC-7721;对照组为转染空载体pGPU6/GFP/neo-shNC的7721-shNC细胞;实验组为转染p53重组真核表达质粒pGPU6/GFP/neo-p53-shRNA的7721-p53-shRNA细胞。
2.3稳定细胞系的鉴定
参照李燕等[5]的方法,用RT-PCR方法检测p53mRNA表达。
2.4主要观察指标
2.4.1用WesternBlotting检测p53和p125蛋白表达[5]5]
按“2.2”的方法进行分组和处置,培养16d后,收集各组细胞,提取总蛋白,用Nanodrop检测蛋白浓度。按照每孔上样60μg,进行SDS-PAGE电泳,然后转膜、封闭、孵育一抗抗体、洗涤、孵育相应种属远红外680和800nm标记二抗,最后用Odyssey远红外扫描仪进行扫描,成像。
2.4.2用RT-PCR检测POLD1、视网膜母细胞瘤蛋白1(Rb1)、转录因子E2F、细胞周期依赖性蛋白激酶2(CDK2)及细胞周期素E(CylinE)的表达水平[5]5]
按“2.2”的方法进行分组和处置,培养16d后,收集各组细胞,参照SYBRGreenqPCRKit说明书制备检测样品,建立PCR产物的荧光扩增曲线和溶解曲线,测定每个样品POLD1、Rb1、转录因子E2F、CDK2及CylinE基因和β-actin的Ct值,每个样品6个复孔。经产物特异性检测后,用7500SoftwareV2.0.5分析数据。
2.5次要观察指标
2.5.1用噻唑蓝法检测细胞生长速率指标[5]5]
按“2.2”的方法进行分组和处置后,调整细胞密度为5×104cell·mL-1,接种至含10%胎牛血清及双抗的RPMI1640培养基中培养。分别培养24,48,72,96,120,144和168h后,用噻唑蓝进行细胞染色,在570和630nm双波长下用酶标仪检测光密度(OD)值。
2.5.2用细胞克隆形成实验测定细胞集落形成率[6]6]
调整单细胞悬液浓度为250cell·mL-1,每孔4mL接种于6孔板,按“2.2”的方法进行分组和处置,每组平行3孔。培养10d后,Giemsa染色,显微镜下观察、计数每孔含50个细胞以上的细胞克隆数并拍照,计算细胞克隆形成率。
3、统计学处理
用SPSS13.0进行统计分析。实验数据用x¯±s表示,比较用t检验。
结果
1、质粒转染SMMC-7721后绿色荧光蛋白的表达
转染12和24h后,每个视野中可见的荧光数不多,强度很弱。转染36和48h后,荧光数目增多,亮度变强。结果见图1。这表明质粒已经成功转染细胞,并能在细胞内表达。
图1质粒pGPU6/GFP/neo-p53-shRNA稳定转染SMMC-7721细胞不同时间荧光表达
2、RNA干扰后RT-PCR方法检测p53mRNA表达
实验组、对照组和空白组的p53mRNA表达水平分别为0.15±0.23,1.05±0.11和1.00±0,实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),对照组与空白组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。这表明稳定转染的质粒对p53mRNA表达水平起到了调节作用。
3、WesternBlotting分析p53RNA干扰后p125蛋白表达水平影响
实验组、对照组和空白组的p125蛋白表达水平分别为2.86±0.21,2.20±0.28和2.24±0.25,p53蛋白表达水平分别为0.22±0.03,0.55±0.07和0.53±0.06,实验组的上述指标与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05),而对照组与空白组的上述指标比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结果见图2。这表明在蛋白水平上p53对p125起着相应的负性调节的作用。
图2WesternBlotting检测转染细胞中p53及p125蛋白表达情况
4、RT-PCR检测基因的表达水平
实验组的POLD1、Rb1、转录因子E2F、CDK2和CyclinE基因表达水平与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05),但对照组的上述指标和空白组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结果见表1。
5、p53RNA干扰后细胞生长速率的变化
对照组不同时间点的OD值与空白组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。实验组不同时间点的OD值与对照相比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表2。
6、细胞克隆形成实验
实验组、对照组和空白组的克隆数分别为437.00±15.74,257.00±9.54和217.00±6.66,克隆形成率分别为45.50%,25.70%和21.90%,实验组的上述指标与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05),对照组的上述指标与空白组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。
表1DNA聚合酶δ催化亚基基因1(POLD1)及其他细胞周期因子mRNA相对表达水平
表2各组细胞不同时间点的生长速率的比较
讨论
肝癌的发生、发展、恶化与癌细胞的恶性增殖息息相关。癌细胞的大量增殖过程需要大量的DNA合成,polδ是唯一与细胞周期相关的真核生物DNA复制酶,其活性的强弱、量的高低,与细胞周期和DNA的复制息息相关,从而推测其与癌细胞的恶性增殖也存在着密切关系。SANEFUJI等[7]通过免疫组织化学的方法显示,肝癌细胞核内polδ催化亚基p125的表达阳性率显著高于正常肝组织,并且p125的表达与细胞的分化及血管侵袭的程度有关。欧贤红等[3]通过RT-PCR及WesternBlotting的方法也发现肝癌组织POLD1基因及p125蛋白的表达水平均明显高于癌旁组织。这提示p125的高表达可能与肿瘤的发生、发展有重要的关系。
p53是一个重要的肿瘤抑制基因,在细胞增殖抑制、凋亡诱导中起重要作用[8,9]。p125的编码基因POLD1启动子上的P4序列可被野生型p53通过与Sp1竞争性结合,从而抑制POLD1基因mRNA的表达[10]。本研究通过RNA干扰技术沉默SMMC-7721肝癌细胞中p53的表达,发现肝癌细胞中p53低表达后,细胞周期相关因子Rb1、转录因子E2F、CDK2、CyclinE和POLD1mRNA的表达量及p125蛋白表达量均明显增高。这说明p53可能通过多种途径参与POLD1和p125的调控。本课题组通过生长速率检测、细胞集落形成率等实验,发现肝癌细胞中p53表达降低后,SMMC-7721细胞的生长速率有所增加,单细胞锚定依赖性成克隆能力增强。这说明p53对p125的调控作用可能是p53对细胞增殖和细胞恶性表型影响的一种新分子通路。
参考文献：
[3]欧贤红,廖柳凤,刘华钢,等.POLD1基因在原发性肝癌中的表达及其意义[J].世界华人消化杂志,2011,19(2):151-155.
[5]李燕,张健.细胞与分子生物学常用实验技术[M].西安:第四军医大学出版社,2009:8-11,62-75,172-191.
[6]朴英实,林贞花.分子病理生物学实验技术指南[M].北京:人民军医出版社,2015:48-50.
[9]尹东亮,卢沛林,尹润龙,等.过表达PRRX1通过p53介导的线粒体凋亡途径诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2019,26(6):662-668.
廖柳凤,欧贤红,吴琼,徐恒,李艳,刘华钢.shRNA-p53对p125表达及肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响[J].中国临床药理学杂志,2020,36(16):2428-2431.
基金:国家自然科学基金资助项目(81260657)
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目前针对中晚期肺鳞癌仍缺乏可靠的治疗对策｡临床主要采取化疗,通过专门的药物杀灭肿瘤细胞以缓解临床症状及延长生存时间｡化疗药物多种多样,虽然许多化疗药物对肿瘤的杀灭效果较好,但不良反应也比较突出[3]｡紫杉醇加铂类一线治疗,如紫杉醇+顺铂既往被广泛用于控制肺鳞癌进展,但不良反应明显,对疾病进展抑制效果欠佳[4]｡
2025-08-22
妇科恶性肿瘤是严重威胁女性健康的主要疾病之一,其发病率和病死率在全球范围内居高不下[1]｡尽管近年来妇科肿瘤的诊疗水平取得了显著提升,但晚期患者的生存预后仍不理想,尤其是复发及耐药患者的治疗选择十分有限｡目前,随着精准医学的发展,靶向治疗已成为改善妇科肿瘤预后的关键策略｡
2025-07-24
在肿瘤标记物SERS免疫分析结构中,“抗体—抗原SERS探针”的夹心检测结构是最典型的一种[11]｡SERS探针由内到外依次为:金纳米颗粒(Aunanoparticles,AuNPs)作为拉曼增强介质[12],具有明显拉曼信号的拉曼分子,以及可特异性捕获目标抗原的抗体｡SERS信号的强度取决于被吸附的SERS探针的数量,而这又取决于被吸附的抗原的数量｡
2025-06-16
食管癌最常见的病理类型是鳞癌和腺癌,其中我国的食管癌病理类型以鳞癌居多｡临床上患者常因进食哽噎及吞咽不适就诊[3]｡食管癌的治疗以手术和化疗为主[4-5]｡有研究表明食管鳞癌术后辅助化疗可延长患者的无病生存期,总生存期则无明显改善[6]｡
2025-05-21
癌胚抗原(CEA)､糖类抗原199(CA199)､糖类抗原125(CA125)和人附睾蛋白4(HE4)作为现如今应用较广泛的血清肿瘤标志物,在EOC的早期诊断､临床分期和预后评估等方面均发挥了重要作用[3⁃4]｡近年来相关研究也指出[5],肿瘤的影像学特征可能与血清肿瘤标志物存在一定关联｡但目前关于EOC患者CT特征与血清肿瘤标志物的关系尚未统一定论｡
2025-04-27
肺癌中非小细胞肺癌(NSCLC)占80%~85%,包括鳞癌和腺癌等组织亚型,有75%的NSCLC患者在诊断之初就发生了转移和浸润,平均生存期仅为2年｡虽然目前有多种新的治疗方法引入临床,但NSCLC的5年生存率仅为15%〔2〕｡因此寻找有效的预后预测指标和治疗靶点显得至关重要｡
2025-03-12
Grogg等[4]报道的110例LELGC中,未有1例同时出现EBV阳性和MSI-High,这与其他病例报道的结果一致,提示了EBV感染和MSI-High可能是参与LELGC不相关的两个病因通路,但是无论哪种亚型,LELGC都会出现淋巴细胞的广泛浸润,可能与患者预后较好有关｡
2025-02-25
肺癌是中国最常见的癌症，2022 年，中国有870 982 例新发肺癌病例和 766 898 例肺癌死亡病。非小细胞肺癌约占所有肺癌的 80%~84%，包括腺癌（30%~50%）、鳞癌（20%~35%）和大细胞癌（9%）。小细胞癌约占所有肺癌16%~20%。其他非小细胞肺癌亚型，如肉瘤样癌、腺鳞癌等，为少见类型。
2025-01-21
肺癌死亡人数占全球死亡总人数的 18% ,而非小细胞肺癌(NSCLC)患病人数占肺癌患病人数的 85% 左右｡ 目前治疗早期 NSCLC 的有效手段仍然是手术联合辅助治疗如免疫､化疗等治疗方式,与单纯手术治疗相比,外科手术联合围术期免疫治疗和化疗在延长患者总生存期方面具有显著优势｡
2024-12-23
软骨肉瘤 (chondrosarcoma) 是一种以产生软骨基质为特征的恶性骨肿瘤。其发病率仅次于骨肉瘤，占恶性骨肿瘤的 17%～24%。骨盆是最常见的发病部位，占到全部患者的 22%～39%。软骨肉瘤分为多种亚型，经典型软骨肉瘤最常见，约占 90% 以上。根据病理分类，骨盆软骨肉瘤可分为 Ⅰ～Ⅲ 级。
2024-11-21
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期刊名称：中国癌症防治杂志
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主管单位：国家卫生和计划生育委员会
主办单位：中国医师协会,广西肿瘤防治研究所
出版地方：广西
专业分类：医学
国际刊号：1674-5671
国内刊号：45-1366/R
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创刊时间：1984年
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2020-08-27
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