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达格列净调控JAK2/STAT3轴对大鼠缺血性室性心律失常的作用

2024-02-18 15 上传者：管理员

摘要：目的探讨达格列净(DAPA)调控蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)/信号转导子与激活子3(STAT3)轴对大鼠缺血性室性心律失常(VA)的作用及机制研究。方法将大鼠随机分为假手术组、模型组和低、中、高剂量实验组及AG490组，每组10只。除假手术组外各组用结扎冠状动脉左前降支(LAD)构建大鼠缺血性VA模型。造模后48 h,低、中、高剂量实验组分别给予大鼠1、3、5 mg·kg-1 DAPA灌胃，AG490组灌胃5 mg·kg-1 DAPA+5 mg·kg-1 AG490,每日1次，持续30 d。用心电图检查大鼠心律失常评分，用蛋白质印迹法检测心肌组织中磷酸化JAK2(p-JAK2)/JAK2和磷酸化STAT3(p-STAT3)/STAT3蛋白的表达水平。结果假手术组、模型组、低、中、高剂量实验组和AG490组的心律失常评分分别为(0.00±0.00)、(4.36±0.52)、(3.41±0.42)、(2.84±0.33)、(2.13±0.26)和(3.74±0.43)分，p-JAK2/JAK2相对表达水平比值分别为0.98±0.10、0.41±0.05、0.62±0.07、0.74±0.08、0.91±0.09和0.52±0.06,p-STAT3/STAT3相对表达水平比值分别为0.93±0.09、0.33±0.04、0.57±0.06、0.78±0.08、0.89±0.09和0.49±0.05。模型组的上述指标与假手术组、低、中、高剂量实验组比较，AG490组的上述指标与高剂量实验组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 DAPA可能通过激活JAK2/STAT3信号通路，抑制炎症反应和氧化应激，改善大鼠缺血性VA。

关键词：
室性心律失常
猝死
缺血性室性心律失常
蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子与激活子3
达格列净
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室性心律失常(ventricular arrhythmia, VA)主要是致死性心律失常，是急性心肌缺血等心源性猝死的主要原因[1]。研究表明，在心肌缺血期间，交感神经系统过度激活并释放神经递质，导致心电活动不稳定，导致VA的发生[2]。达格列净(dapagliflozin, DAPA)具有心脏保护作用，具有抗VA并改善心脏功能的作用[3]。Janus酪氨酸激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/信号转导子与激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号通路是一种重要的细胞内信号转导途径，参与细胞应激、免疫调节、增殖和凋亡。已有研究指出，JAK2/STAT3通路在心脏保护中发挥作用，且与冠状动脉微栓塞术后室性心律失常的发生有关[4]。本研究通过构建缺血后VA模型，探究DAPA对缺血后VA的作用及机制。

一、材料与方法

1 材料

动物SD雄性大鼠60只，鼠龄8～10周，体质量200～300 g, 购自广东南模生物科技有限公司。动物生产许可证号：SCXK(粤)2022-0062。本研究经南华大学附属第二医院动物伦理委员会批准(伦理批号：20210051506)。

试剂与仪器达格列净片，规格：每片5 mg, 批号：20211026,批准文号：国药准字H20213815,山东鲁抗医药股份有限公司生产；JAK2/STAT3通路抑制药AG490,批号：HY-12000,规格：每瓶100 mg, 纯度：99.97%,美国Med Chem Express公司生产。苏木精-伊红(hematoxylin eosin, HE)染色液、丙二醛(malondialdehyde, MDA),均由上海源叶生物科技有限公司生产；马森(Masson)试剂盒，上海联迈生物工程有限公司生产；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)试剂盒、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均由上海翌圣生物科技公司生产；白细胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6 ELISA试剂盒，均由上海酶研生物科技有限公司生产；一抗JAK2、磷酸化JAK2(phosphorylated-JAK2,p-JAK2)、STAT3、p-STAT3和3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH),均由美国Abcam公司生产；辣根过氧化物酶偶联的二抗，武汉华美生物工程有限公司生产。

仪器DW-3000S小动物呼吸机，安徽正华生物仪器有限公司产品；DM4000显微镜，德国莱卡公司产品；1645052电泳仪，美国伯乐公司产品。

2 实验方法

2.1 模型构建[5]5]

用结扎冠状动脉左前降支(left anterior descending, LAD)构建大鼠缺血性模型：将大鼠麻醉后仰卧位固定，气管插管后用小动物呼吸机进行机械通气，大鼠四肢连接BL-420S生物机能检测仪，积累标准Ⅱ导联心电图。打开胸腔，暴露心脏，用6-0尼龙线结扎LAD,尼龙线穿过左心室下约2～3 mm处，缝合切口使大鼠自主呼吸。心电图显示ST段抬高，表明心脏局部缺血。假手术组大鼠除不结扎，进行相同手术操作。

2.2 动物分组与给药方法

将大鼠随机分为假手术组、模型组、AG490组和低、中、高剂量实验组，每组10只。造模后48 h后，假手术组和模型组均给予相同剂量蒸馏水，低、中、高剂量实验组分别给予大鼠1、3、5 mg·kg-1 DAPA灌胃[3],AG490组灌胃5 mg·kg-1 DAPA+5 mg·kg-1 AG490[6]。6组大鼠每日给药1次，持续30 d。

2.3 标准Ⅱ导联心电图检查大鼠心电图指标变化[7]7]

造模完成后，监测各组大鼠标准Ⅱ导联心电图，测量PR间期、QRS波群时间、QT间期(QTc interval prolongation, QTc),并记录室性早搏(ventricular premature, VP)、室性心动过速(ventricular tachycardia, VT)、心室颤动(ventricular fibrillation, VF)出现时间。VT包括连续3个或3个以上的室性早搏；持续VT为持续10 s及以上。用Curist-Walker评分系统对心律失常进行评分[8]。

2.4 HE、Masson染色法观察大鼠心肌组织病理学变化[9,10]9-10]

麻醉处死大鼠，取大鼠心肌组织，4%多聚甲醛中固定过夜，包裹在石蜡中，切片成4 μm切片，脱蜡后进行HE染色、Masson染色，脱水、封片，观察心肌组织病理学变化。

2.5 试剂盒检测血清中MDA、SOD、GSH水平[11]11]

取大鼠静脉血，离心取上清液，按照试剂盒说明书进行操作，检测MDA、SOD、GSH水平。

2.6 ELISA试剂盒检测血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平[12]12]

取大鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测IL-1β、TNF-α、IL-6水平。

2.7 蛋白质印迹法检测心肌组织JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平[13]13]

取大鼠心肌组织，洗涤，置于-80 ℃保存。使用裂解缓冲液裂解冷冻心肌组织，提取蛋白质，分离并转移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭后，PVDF膜与一抗JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和GAPDH(1∶2 000)孵育过夜，后将膜与二抗(1∶2 000)在室温下孵育1 h。使用凝胶成像系统观察，并用Image J进行分析。

3 统计学处理

用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以表示，多组间比较用单因素方差分析，2组间比较用SNK-q检验。

二、结果

1 DAPA对各组大鼠PR间期、QRS波群时间、QTc的影响

假手术组和模型组均给予等剂量蒸馏水；低、中、高剂量实验组分别给予1、3、5 mg·kg-1 DAPA;AG490组给予5 mg·kg-1 DAPA+5 mg·kg-1 AG490。

模型组与假手术组比较，低、中、高剂量实验组与模型组比较，AG490组与高剂量实验组比较，QTc、PR间期、QRS波群时间在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表1。

2 DAPA对各组大鼠VP、VT、VF出现时间和心律失常评分的影响

低、中、高剂量实验组与模型组比较，AG490组与高剂量实验组比较，VP、VT、VF出现时间、心律失常评分在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表2。

表1 各组大鼠QTc、PR间期、QRS波群时间的比较

图1 各组大鼠心肌组织苏木精-伊红(A)和Masson(B)染色图(×200)

3 DAPA对各组大鼠病理学变化的影响

HE染色结果显示：假手术组大鼠心肌结构完整，纤维排列整齐，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠心肌结构损伤，纤维排列紊乱，心肌细胞减少，大量炎性细胞浸润；低、中、高剂量实验组大鼠心肌损伤改善，纤维排列有序，炎性细胞减少，其中高剂量实验组改善最明显；AG490组相比于高剂量实验组大鼠心肌结构明显损伤，见图1A。

Masson染色结果显示：假手术组大鼠心肌组织完整，少量蓝色胶原纤维；模型组大鼠组织紊乱，大量蓝色胶原纤维；低、中、高剂量实验组大鼠心肌组织改善，蓝色胶原纤维减少，其中高剂量实验组减少最明显；AG490组相比于高剂量实验组大鼠蓝色胶原纤维有所增加，见图1B。

4 DAPA对各组大鼠SOD、MDA、GSH水平的影响

模型组与假手术组比较，低、中、高剂量实验组与模型组比较，AG490组与高剂量实验组比较，MDA、SOD、GSH水平在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表3。

表3 各组大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平比较

5 DAPA对各组大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6水平的影响

模型组与假手术组比较，IL-1β、TNF-α、IL-6水平均明显升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);低、中、高剂量实验组与模型组比较，IL-1β、TNF-α、IL-6水平均明显降低，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);AG490组与高剂量实验组比较，IL-1β、TNF-α、IL-6水平均明显升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表4。

6 DAPA对各组大鼠JAK2/STAT3信号通路的影响

假手术组、模型组、低、中、高剂量实验组、AG490组p-JAK2/JAK2相对表达水平比值分别为0.98±0.10、0.41±0.05、0.62±0.07、0.74±0.08、0.91±0.09和0.52±0.06,p-STAT3/STAT3相对表达水平比值分别为0.93±0.09、0.33±0.04、0.57±0.06、0.78±0.08、0.89±0.09和0.49±0.05。模型组与假手术组比较，低、中、高剂量实验组与模型组比较，AG490组与高剂量实验组比较，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

表4 各组大鼠血清白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6水平比较

三、讨论

心肌缺血引起心律失常大多数是VA,而VA是心源性猝死的主要原因。心肌缺血可引起氧化应激损伤、炎症等一系列病理反应[14]。DAPA对心血管疾病也有较好的治疗作用，其主要通过减轻离子稳态失调、线粒体功能障碍、氧化应激、炎症和心脏凋亡的能力发挥作用[15]。本研究中DAPA治疗后大鼠心肌损伤改善，心肌纤维化减少，且PR间期、QTc缩短，QRS波群时间减少，VP、VT、VF出现时间显著延长，心律失常评分显著降低，血清MDA、TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低，SOD、GSH显著升高。这表明DAPA可能通过抑制心肌组织氧化应激、炎症反应，减少心肌损伤，改善缺血性VA。

JAK2是非受体酪氨酸激酶的一种亚型，JAK2激活后可触发STAT3磷酸化，导致特定靶基因的表达增加，参与炎症、内皮细胞分化、血管生成和细胞凋亡[16]。研究表明，JAK2/STAT3信号通路激活可抑制炎症和氧化反应，减少心律失常和心肌梗死，增强心脏功能[17]。本研究中，模型组心肌组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达水平均显著降低，表明缺血性VA心肌组织中JAK2/STAT3信号被抑制；经DAPA治疗后，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达水平均显著升高，提示DAPA对缺血性VA的心脏保护作用可能是通过激活JAK2/STAT3信号通路来实现的，且JAK2/STAT3通路抑制药AG490逆转DAPA对VA的心脏保护作用。

参考文献:

[5]王萌,马洪军,高玉华,等.布托啡诺通过微小RNA-1-3p(miR-1-3p)上调连接子蛋白43(Cx43)通路减轻SD大鼠缺血性心律失常[J].细胞与分子免疫学杂志,2020,36(11):990-995.

[7]张祉思,程婉秋,江涛,等.基于钙超载研究滇乌碱诱导大鼠心律失常的毒性机制[J].中国药房,2021,32(23):2854-2858.

[8]郭子静,刘刚,马可心,等.养心定悸胶囊对异丙肾上腺素诱导SD大鼠缺血性心律失常的拮抗作用及机制[J].中华中医药学刊,2022,40(1):97-102,268-269.

[9]蒋淼,刘德明,陈薇,等.甘草次酸对乌头碱致大鼠心律失常的拮抗作用[J].中药药理与临床,2021,37(4):132-137.

基金资助:湖南省自然科学基金资助项目(2021JJ30608);

文章来源:凌静,吴瑶,田国平.达格列净调控JAK2/STAT3轴对大鼠缺血性室性心律失常的作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(03):388-392.