原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一种缓慢的进行性慢性肝病，主要影响中老年妇女，PBC病因复杂，以胆汁淤积和自身免疫对肝结构的进行性破坏为特征，可逐渐发展为肝硬化、肝纤维化等终末期肝病[1]。在中医理论中，PBC归属于“黄疸”“积聚”等范畴。中医治疗PBC的安全性较强、疗效确切，可通过多途径、多靶点达到治疗PBC的作用[2]。大黄素广泛存在于大黄、虎杖等多种中草药中，其具有显著的抗炎功效[3]。肝是清除细菌源性脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的主要器官，在PBC中，胆管上皮细胞可通过门静脉循环暴露于高水平的肠道微生物来源的LPS[4]。本研究将通过使用LPS刺激肝内胆管上皮细胞模拟体外PBC细胞模型，探讨大黄素对PBC的治疗作用，及其可能的潜在机制。

一、材料与方法

1 材料

细胞

大鼠肝内胆管上皮细胞，购自美国ATCC公司。

药品与试剂

大黄素，规格：每管1 g, 纯度：95%,批号：20230118,上海源叶生物科技有限公司产品。Toll-样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)、磷酸化核转录因子κB(phosphorylation-nuclear factor kappa B, p-NF-κB)、p65、原癌基因(c-myc)、细胞增殖核抗原Ki67(cell proliferation nuclear antigen Ki67,Ki67)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌蛋白(Alpha smooth muscle protein, α-SMA)、S100钙结合蛋白A4(S100 calcium-binding protein A4,S100A4)一抗，均购自英国Abcam公司；增强型化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)试剂盒，购自上海翌圣生物科技股份有限公司；细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8, CCK-8)细胞增殖试剂盒，购自长沙艾碧维生物科技有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂，购自深圳子科生物科技有限公司；白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、γ干扰素(gamma interferon, IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均购自上海化邦生物科技有限公司；BeyoClickTM EdU-488细胞增殖检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司。

仪器

UMR-9600全自动酶标仪，杭州优米仪器有限公司产品；Bolt TM Bis-Tris Plus预制凝胶蛋白电泳系统，美国Life Tech公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养[5]5]

将细胞培养在DMEM培养基(含有1%青-链霉素和10%胎牛血清)中，并置于培养箱(5% CO2,37 ℃)中培养，待细胞密度达80%左右时进行后续实验。

2.2 细胞分组与处置方法

将细胞随机分为对照组、模型组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组和pcDNA-TLR4组。对照组细胞正常培养；模型组用20 μg·mL-1 LPS处理细胞24 h以建立体外胆管上皮细胞炎性模型[5];低、中、高剂量实验组分别用5、10、20 μg·mL-1大黄素和20 μg·mL-1 LPS共同处理细胞24 h; pcDNA-TLR4组细胞转染pcDNA TLR4过表达质粒48 h后，用20 μg·mL-1大黄素和20 μg·mL-1 LPS共同处理细胞24 h。

2.3 蛋白质印迹法检测细胞中蛋白的表达水平[6]6]

收集各组细胞，使用RIPA裂解液提取总蛋白，然后二辛可宁酸法(bicinchoninic acid method, BCA)法测定蛋白浓度，并取蛋白样品40 μg进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(100 V恒压),结束后电转膜至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜(90 V,2 h),然后使用5%的脱脂奶粉浸泡PVDF膜，室温封闭2 h, 结束后加入稀释的一抗试剂(均为1∶1 000),4 ℃孵育过夜，次日洗膜缓冲液(Tris buffered saline Tween, TBST)清洗后加入稀释的二抗试剂(1∶5 000),然后滴加ECL发光试剂进行显影曝光，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参进行灰度值分析。

2.4 CCK-8实验检测细胞存活率[7]7]

将细胞接种于96孔板中(1×105cell·mL-1),培养箱中培养24 h, 按照“2.2”中方法进行分组处理，处理结束后每孔加入CCK-8试剂20 μL,然后培养箱避光结合4 h后，用酶标仪检测光密度值(450 nm),并计算细胞存活率。

2.5 5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-acetylene-2’-deoxyuridine, Edu)实验检测细胞增殖情况[8]8]

将细胞接种于96孔板中(1×105 cell·mL-1),培养箱培养24 h, 按照“2.2”中方法进行分组与处理，后弃原有培养液，然后加入配制好的Edu溶液(按照Edu试剂∶完全培养液=1∶1 000的比例配制)100 μL,培养箱孵育2 h, 然后用磷酸缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)清洗后，加入细胞固定液室温结合15 min, 用PBS清洗后，加入2 mg·mL-1甘氨酸试剂50 μL,室温结合10 min, 用PBS清洗后，加入0.3%TritonX-100 100 μL,室温结合10 min后，加入反应液，室温遮光结合30 min。用Hoechst33342进行细胞核复染(室温避光，30 min, 蓝色荧光),最后用荧光显微镜观察。

2.6 ELISA法检测各组细胞炎性因子表达水平[9]9]

按照“2.2”中方法进行分组与处理细胞，以3 000 r·min-1离心15 min后，收集细胞上清液，然后进行检测各组细胞上清中相关因子表达水平，分别设置空白孔、待测样品孔和标准样品孔，然后严格按照试剂盒说明添加相关样品及试剂，并检测光密度值，制作标准曲线，根据标准曲线计算IL-6、IFN-γ、TNF-α含量。

3 统计学处理

用SPSS 23.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用表示，多组间比较用one-way ANOVA分析，2组间比较用LSD-t检验。

二、结果

1 大黄素对LPS诱导的细胞中TLR4/NF-κB/c-myc信号通路的影响

对照组给予正常培养；模型组给予20 μg·mL-1 LPS;低、中、高剂量实验组分别给予20 μg·mL-1 LPS+5、10、20 μg·mL-1大黄素；pcDNA-TLR4组转染pcDNA-TLR4质粒+20 μg·mL-1 LPS+20 μg·mL-1大黄素。

低、中、高剂量实验组与模型组比较，细胞TLR4、p-NF-κB p65、c-myc蛋白相对表达水平在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),且各剂量实验组间在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);模型组与对照组比较，pcDNA-TLR4组与高剂量实验组比较，细胞TLR4、p-NF-κB p65、c-myc蛋白相对表达水平在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表1。

2 大黄素对LPS诱导的细胞增殖的影响

对照组、模型组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、pcDNA-TLR4组的细胞存活率分别为(100.00±5.90)%、(193.33±21.01)%、(165.03±11.36)%、(140.96±10.45)%、(124.19±12.80)%和(148.77±10.67)%,Edu阳性细胞率分别为(22.11±1.18)%、(51.78±2.35)%、(43.20±3.76)%、(33.19±3.58)%、(26.96±2.31)%和(41.40±2.74)%。低、中、高剂量实验组与模型组比较，细胞存活率和Edu阳性细胞率在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),且各剂量实验组间在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);模型组与对照组比较，pcDNA-TLR4组与高剂量实验组比较，细胞存活率和Edu阳性细胞率在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见图1。

3 大黄素对LPS诱导的细胞增殖相关蛋白表达的影响

低、中、高剂量实验组与模型组比较，Ki67、PCNA、CyclinD1蛋白相对表达水平在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),且各剂量实验组间在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);模型组与对照组比较，pcDNA-TLR4组与高剂量实验组比较，Ki67、PCNA、CyclinD1蛋白相对表达水平在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表2。

表1 各组细胞Toll-样受体4/磷酸化核转录因子κB/原癌基因(TLR4/p-NF-κB/c-myc)信号相关蛋白表达的影响

4 大黄素对LPS诱导的细胞炎性因子表达的影响

低、中、高剂量实验组与模型组比较，IL-6、IFN-γ、TNF-α水平在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),且各剂量实验组间在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);模型组与对照组比较，pcDNA-TLR4组与高剂量实验组比较，细胞IL-6、IFN-γ、TNF-α水平在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表3。

5 大黄素对LPS诱导的细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响

低、中、高剂量实验组与模型组比较，E-cadherin、α-SMA、S100A4蛋白相对表达水平在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),且各剂量实验组间在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);模型组与对照组比较，pcDNA-TLR4组与高剂量实验组比较，E-cadherin、α-SMA、S100A4蛋白相对表达水平在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表4。

图1 5-乙炔基-2’-脱氧尿苷法检测各组细胞增殖情况(×200)   

表2 各组细胞增殖相关蛋白表达的比较

表3 各组细胞炎性因子表达的比较

表4 各组细胞上皮间质转化标志蛋白表达的比较

三、讨论

大黄素具有抗氧化、抗纤维和抗炎等功效。既往研究表明，大黄素可通过多种途径改善肝炎损伤[10,11],然而大黄素对PBC中的作用机制仍不明确。在本研究中，通过体外实验观察到，LPS诱导的胆管上皮细胞的存活率及Edu阳性细胞率及促增殖相关蛋白Ki67、PCNA、CyclinD1表达水平均明显提高，且促炎细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α水平均显著上调，而大黄素处理后，胆管上皮细胞存活率、Edu阳性细胞率及Ki67、PCNA、CyclinD1蛋白表达水平，以及IL-6、IFN-γ、TNF-α因子水平均随着大黄素剂量的增加显著下降，提示大黄素可能通过抑制胆管上皮细胞异常增殖改善PBC炎性损伤。

EMT是上皮细胞向间质细胞转化的一种生物学特性现象。研究表明，PBC的胆管上皮细胞可发生EMT加重PBC进展[12,13]。本研究中，LPS诱导后，胆管上皮细胞中E-cadherin表达水平明显下调，α-SMA、S100A4表达水平均明显上调，而大黄素处理后，E-cadherin表达水平不断升高，α-SMA、S100A4表达水平均不断降低，提示大黄素可能通过抑制胆管上皮细胞EMT控制PBC炎症进展。

进一步探究大黄素作用机制发现，大黄素处理后，可显著降低LPS诱导的TLR4、p-NF-κB p65、c-myc蛋白上调。既往研究表明，TLR4/NF-κB/c-myc信号通路在PBC中被激活[14]。本研究结果提示：大黄素可能通过抑制TLR4/NF-κB/c-myc信号发挥其抗炎作用。进一步通过转染TLR4过表达质粒，观察到过表达TLR4后可显著逆转大黄素对LPS诱导的胆管上皮细胞增殖和炎性反应及EMT的影响。

参考文献:

[2]戚璐,徐俊,许杰,等.基于网络药理及分子对接探讨茵陈五苓散治疗原发性胆汁性胆管炎的作用机制[J].世界中医药,2021,16(2):206-214,221.

[3]王延海,张雷明,冯艳艳.大黄素改善高糖条件中人肾小球血管内皮细胞炎症､氧化应激及凋亡作用的研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(10):1422-1426.

[4]李承积,俞渊,甘苡榕,等.LPS诱导胆管炎症对胆管上皮细胞骨架形态学变化的影响及大黄灵仙方对其干预机制研究[J].海南医学院学报,2022,28(10):750-755.

[5]李承积,俞渊,甘苡榕,等.LPS诱导胆管炎症对胆管上皮细胞骨架形态学变化的影响及大黄灵仙方对其干预机制研究[J].海南医学院学报,2022,28(10):750-755.

[6]曹征,谢连娣,范宗静,等.黄芪多糖联合lncRNA TUG1沉默对缺血再灌注人心脏微血管内皮细胞凋亡的影响[J].世界中医药,2021,16(21):3185-3190.

[7]陈润铭,杜玉青,李友山,等.复方黄柏液对糖基化内皮细胞增殖迁移成管的影响[J].世界中医药,2022,17(8):1071-1076.

[8]艾馨.CXCR1/CXCL8轴通过ERK-NF-κB信号通路调控原发性胆汁性胆管炎中胆管上皮细胞异常增殖的机制研究[D].云南昆明:昆明医科大学,2021.

[9]杜青,陈林,贺炜,等.黄精多糖对RAW 264.7细胞活性及炎症因子TNF-α､IL-6､iNOS表达的影响[J].中成药,2022,44(8):2676-2679.

[10]寇小妮,解新科,郝明霞,等.大黄素介导IRS-2/PI3K/Akt通路干预大鼠非酒精性脂肪性肝炎的实验研究[J].疑难病杂志,2020,19(1):80-84.

[11]郑文彬,鄢素琪,汤建桥,等.钙敏感受体在急性淤胆型肝炎模型大鼠中的表达及大黄素的作用[J].中成药,2022,44(8):2664-2667.

[13]杨再兴,梁艳,刘东红,等.低氧/低氧诱导因子-1α通过TGF-β1诱导人肝内胆管上皮细胞上皮间质转化[J].温州医科大学学报,2021,51(1):40-44.

[14]姚晨辉.LINC00311在LPS诱导人肝内胆管上皮细胞激活TLR4/NF-κB/c-myc信号通路从而上调内源性β-葡萄糖醛酸酶表达过程中的作用[D].辽宁沈阳:中国医科大学,2019.

文章来源:闫凯,刘旭呈.大黄素对脂多糖诱导的胆管上皮细胞炎症反应的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(03):368-372.