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LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中多黏菌素B和替加环素的浓度

2024-04-12 59 上传者：管理员

摘要：目的建立大鼠血浆中多黏菌素B和替加环素测定的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法，并研究其在大鼠体内的药代动力学特征。方法用3%三氯乙酸-甲醇溶液(50∶50)对大鼠血浆进行沉淀蛋白处理。色谱柱：Symmetry C18(150.0 mm×4.6 mm, 3.5μm),流动相：0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈，流速：0.6 mL·min-1,柱温：40℃;离子源：电喷雾离子源，正离子检测模式，多反应检测。考察该方法的专属性、标准曲线和定量下限、精密度与回收率、稳定性以及重现性。结果替加环素的线性范围为25～2 500 ng·mL-1,定量下限为25 ng·mL-1,提取回收率为95.89%～107.90%;多黏菌素B1+1-I的线性范围为82～8 200 ng·mL-1,定量下限为82 ng·mL-1,提取回收率为93.84%～97.70%;多黏菌素B2的线性范围为9～900 ng·mL-1,定量下限为9 ng·mL-1,提取回收率为96.41%～104.80%;各个物质的日内、日间相对标准偏差均小于10%,稳定性和重现性良好。结论本方法操作简单、灵敏度高、分析时间短，适用于大鼠血浆中多黏菌素B和替加环素的血药浓度测定以及药代动力学的研究。

关键词：
多黏菌素B
替加环素
液相色谱串联质谱
生物样本测定
药代动力学
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多黏菌素B是从多黏芽孢杆菌培养液中分离的碱性多肽类抗生素，是目前治疗革兰氏阴性菌的最后一道防线[1]。替加环素是在米诺环素结构的基础上对其进行修饰得到的首个甘氨酰环素类抗菌药物，对革兰氏阴性菌同样具有较强的抗菌活性[2]。在临床上常推荐联合替加环素来治疗多重耐药菌的感染[3]。多黏菌素B具有肾毒性，替加环素具有肝毒性，因此在两者联合应用时需要监测血药浓度。本研究旨在建立一种用于大鼠血浆中多黏菌素B和替加环素的分析方法，并确定其在大鼠体内药代动力学研究中的适用性，为后续研究奠定基础。

一、材料和方法

1 材料

动物SPF级雄性SD大鼠，体质量220～240 g, 鼠龄8周，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。动物许可证号：SCXK(京)2019-0008。本实验经河北医科大学第二医院伦理委员会批准(伦理批号：2023-AE248)。

药品多黏菌素B对照品，含量：多黏菌素B1 73.4%、多黏菌素B1-I 8.6%、多黏菌素B2 9.0%,批号：R046V0,购自美国USP公司生产；替加环素对照品，纯度：≥98%,批号：T06J11F107652,购自上海源叶生物有限公司；利血平，含量：99.0%,批号：100041-202015,购自中国食品药品检定研究院；注射用硫酸多黏菌素B,规格：每瓶5.0×105 U,批号：31022631,批准文号：国药准字H31022631,上海上药第一生化药业有限公司生产；注射用替加环素，规格：每瓶50 mg, 批号：20221154,批准文号：国药准字H20133165,南京海辰药业股份有限公司生产。

仪器LC-20AD液相色谱仪，日本岛津公司产品；API4000+三重四极杆质谱仪，美国AB公司产品。

2 给药方法

取健康雄性SD大鼠6只，给药前12 h禁食，实验全程不禁水，先尾静脉注射7.2 mg·kg-1替加环素，随后立即尾静脉注射7.5 mg·kg-1多黏菌素B,分别于给药后0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0和24.0后从眼内眦静脉丛取血0.5 mL,置于含有肝素的干燥EP管中，以1.05×104 r·min-1离心5 min, 取上清液，按照“血浆样本处理”项下进行分析测定。

3 测定条件、标准溶液配制与血浆样本处理

本研究方法学建立和生物样本检测由河北医科大学第二医院完成。

色谱条件色谱柱：Symmetry C18柱(150.0 mm×4.6 mm, 3.5 μm);柱温：40 ℃;自动进样器温度：4 ℃;流动相：0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B);流速：0.6 mL·min-1;进样量：10 μL。梯度洗脱程序：0～0.5 min, 5%→15%B;0.5～3.5 min, 15%→80%B;3.5～4.5 min, 80%B;4.5～6.0 min, 80%→90%B;6.0～8.0 min, 90%B;8.0～8.5 min, 90%→5%B。

质谱条件电喷雾离子源；正离子检测模式；多反应监测模式。离子源电压：4 500 V;离子源温度：500 ℃;气帘气压力：206.84 kPa; 雾化气：344.74 kPa; 辅助气：379.21 kPa; 多黏菌素B1+1-I、多黏菌素B2、替加环素、利血平的检测离子对分别为m/z 602.3→101.2、m/z 595.4→101.3、m/z 586.5→513.1和m/z 609.3→195.0,去簇电压分别为120、110、65和110 V,碰撞电压分别为56、54、33和52 V。

对照品溶液的制备称取硫酸多黏菌素B、替加环素对照品各10 mg, 分别置于10 mL容量瓶中，用20%甲醇定容成质量浓度为1 mg·mL-1的硫酸多黏菌素B、替加环素储备液，摇匀，储存于-40 ℃冰箱中。用20%甲醇稀释成一系列浓度的对照品溶液，置于4 ℃冰箱保存，备用。

内标溶液的制备称取利血平对照品5 mg, 置于10 mL容量瓶中，用20%甲醇水定容成质量浓度为500 μg·mL-1的内标储备液；再用20%甲醇水稀释成0.5 μg·mL-1的内标工作液，置于4 ℃冰箱保存，备用。

血浆样品处理量取大鼠血浆样品200 μL于1.5 mL的离心管中，加入内标工作液20 μL,涡旋混匀后加入3%三氯乙酸-甲醇溶液(50∶50)蛋白沉淀剂200 μL,涡旋1 min后，以1.09×104 r·min-1离心10 min, 吸取上清液200 μL于进样瓶中，进样量为10 μL。

4 方法学考察

专属性取空白血浆、模拟血浆样品及给药后的真实大鼠血浆样品各6份，按“血浆样品处理”项下的方法进行处理和分析，比较空白血浆中的内源性杂质对待测物质和内标有无干扰，考察该方法的专属性。

标准曲线与定量下限取空白血浆180 μL加入相应浓度的替加环素、多黏菌素B各10 μL和利血平对照品工作液20 μL,配成多黏菌素B质量浓度分别为1、5、10、20、40、80、100 μg·mL-1(多黏菌素B1+多黏菌素B1-I的质量浓度分别为0.82、4.10、8.20、16.40、32.80、65.60、82.00 μg·mL-1;多黏菌素B2的质量浓度分别为0.09、0.45、0.90、1.80、3.60、7.20、9.00 μg·mL-1),替加环素质量浓度分别为0.25、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、25.00 μg·mL-1;制成一系列的模拟血浆样品，以替加环素(多黏菌素B)与内标峰面积比值为纵坐标(y)。以替加环素(多黏菌素B)的质量浓度为横坐标(x),用加权最小二乘法(1/x2)进行线性回归，并绘制标准曲线。以信噪比(signal-noise ratio, S/N)≥10,计算多黏菌素B和替加环素的定量下限。

精密度和回收率取5个不同批次的大鼠空白血浆，分别加入定量下限、低、中、高4个质量浓度的质控工作液(多黏菌素B的质量浓度依次为1.00、2.00、40.00、80.00 μg·mL-1,替加环素的质量浓度依次为0.25、0.50、10.00、20.00 μg·mL-1)制成模拟血浆样品。按“血浆样品处理”项下的方法进行处理，每个质量浓度平均测定5份，连续测定3 d, 同时测定当日的随行标准曲线。测定待测物质的日内、日间的精密度。取低、中、高3个不同质量浓度的质控工作液，加入空白血浆，按“血浆样品处理”项下的方法进行处理，测得的峰面积(A);空白血浆除不加质控工作液外，其余按“血浆样品处理”项下的方法进行处理，之后再加入低、中、高3个质量浓度的质控工作液，测得峰面积(B);每个质量浓度平行测定5份，以A/B×100%计算提取回收率。

稳定性制备低、中、高3个不同质量浓度的模拟血浆样品，每个质量浓度5个样品；分别在冻融3次、进样器放置12 h、-40 ℃冰箱保存30 d的条件下，按“血浆样品处理”项下的方法进行处理和分析。

5 统计学处理

用DAS 2.0软件通过非房室模型分析主要药代动力学参数。

二、结果

1 方法学评价

专属性如图1所示：在上述条件下，替加环素、多黏菌素B1+1-I、多黏菌素B2和利血平的保留时间分别为2.95、5.20、5.45和5.80 min。这表明空白血浆中的内源性物质不干扰多黏菌素B和替加环素的浓度测定。

图1 模拟血浆样本(A)、多黏菌素B1+1-I(B)、多黏菌素B2(C)、替加环素(D)及内标利血平(E)的色谱图

表1 用液相色谱串联质谱法测定多黏菌素B和替加环素的精密度和回收率

标准曲线与定量下限替加环素在25～2 500 ng·mL-1内，线性关系良好，其标准曲线方程为y=9.17x+2.97×10-2(R2=0.995 3),定量下限为25 ng·mL-1。多黏菌素B1+1-I在82～8 200 ng·mL-1内，线性关系良好，其标准曲线方程为y=3.43×10-1x+1.29×10-2(R2=0.996 8),定量下限为82 ng·mL-1;多黏菌素B2在9～900 ng·mL-1内，线性关系良好，其标准曲线方程为y=6.62×10-2x+1.76×10-3(R2=0.992 6),定量下限为9 ng·mL-1。

精密度与回收率定量下限以及低、中、高4个质量浓度的质控样品中，多黏菌素B、替加环素的日内、日间相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)均在10%以内，替加环素、多黏菌素B1+1-I和多黏菌素B2的提取回收率分别为95.89%～107.90%、93.84%～97.70%、96.41%～104.80%,均符合测定要求。

稳定性低、中、高3个不同质量浓度的模拟血浆样品在进样器放置12 h、反复冻融3次、-40 ℃冰箱保存30 d的回收率均大于90%,RSD均小于10%,稳定性符合测定要求。

2 方法学应用

大鼠尾静脉注射7.2 mg·kg-1替加环素+7.5 mg·kg-1多黏菌素B后的药代动力学参数见表2,平均血药浓度-时间曲线见图2。

表2 大鼠尾静脉注射7.2 mg·kg-1替加环素和7.5 mg·kg-1多黏菌素B后的药代动力学参数

图2 大鼠尾静脉注射7.2 mg·kg-1替加环素(A)和7.5 mg·kg-1多黏菌素B(B)后的血药浓度-时间曲线

三、讨论

多黏菌素B和替加环素在正离子模式解离下峰度较高，在选择内标时发现利血平在正离子模式下响应较高，且比较稳定，故选择其作为内标。实验初期考察了待测物质在水相，以及甲醇、乙腈为有机相的差异，结果发现，有机相为乙腈的峰面积峰高都优于甲醇。多黏菌素B属于极性多肽类化合物，水溶性大，在酸性条件下较为稳定，因此需要提高水相的比例使药物进行解离，故选择在有机相与水相中加入一定浓度的酸，结果发现，在水相加入0.1%的甲酸更有利于维持待测物质的稳定性，改善峰型，减少拖尾。

为降低生物样本中内源性物质对化合物检测造成的信号干扰，需要对生物样品进行去除蛋白处理，目前常用的有固相萃取法、液液萃取法、有机溶剂沉淀蛋白的方法[4,5]。虽然固相萃取法效率高，对待测物质的选择性好，但价格昂贵，操作复杂，不适合大批量样本的测定。本实验初期选择液液萃取法后发现，多黏菌素B的峰高较低且存在严重的拖尾现象故排除；进一步考察了有机溶剂乙腈或甲醇沉淀蛋白的方法，但有机溶剂对多黏菌素B溶解性较差，单用有机溶剂后发现，多黏菌素B的回收率低，不能满足测定的需求。故选择在沉淀蛋白剂中加酸，当加入酸的浓度过低时，不足以将血浆蛋白完全沉淀；当加入酸的浓度过高时，又容易损伤色谱柱。因此，采用酸与有机溶剂结合的方法(1%～5%三氯乙酸与有机溶剂),当三氯乙酸浓度为1%时发现，沉淀得不够完全，当三氯乙酸浓度为3%或5%进行对比后发现，二者对待测物质的峰面积相似，在酸的浓度相同时，甲醇的沉淀效果更好，因此选择3%三氯乙酸-甲醇溶液(50∶50)作为沉淀剂时，各个物质峰形峰面积较好，且能满足各物质的测定需求。

本药代动力学研究结果显示，多黏菌素B的达峰浓度约7.84 μg·mL-1,替加环素的达峰浓度约2.32 μg·mL-1,多黏菌素B的药时曲线下面积(area under curve, AUC)约26.73 mg·L-1·h, 替加环素的AUC约6.37 mg·L-1·h; 多黏菌素B在大鼠体内的半衰期约为4.54 h, 与文献[6]所报道的结果非常接近，替加环素的半衰期约为4.11 h, 在通过尾静脉注射2种药物后，替加环素、多黏菌素B的血药浓度-时间曲线与文献[7,8]报道的相一致。在实验过程中发现，给药之后大鼠会主动地去饮水，猜测可能与激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统有关，该研究有待进一步证实。多黏菌素B和替加环素常联合用药来治疗耐药菌的感染。多黏菌素B属于浓度依赖性抗菌药物，替加环素属于时间依赖性抗菌药物，具有较长的抗菌后效应，2种药物预测抗微生物疗效的最佳药代动力学/药效学指数均为AUC0～24 h/最低抑菌浓度[9,10]。本实验建立了同时测定替加环素联合多黏菌素B的方法，操作简单，分析结果快，具有高灵敏度，适用于大批样本的分析。

参考文献:

[4]冯健男,杜守颖,白洁,等.生物样品前处理的研究进展[J].中国中药杂志,2014,39(21):4143—4148.

[5]董金材,曾鳞粞,王曦,等.生物样品前处理技术在药动学研究中的应用进展[J].中药新药与临床药理,2018,29(1):110—117.

[7]唐棠,黄晓晖,李婷,等.用LC-MS/MS法测定人血清中替加环素的浓度[J].药学服务与研究,2020,20(2):102—106.

[9]中国医药教育协会感染疾病专业委员会.抗菌药物药代动力学/药效学理论临床应用专家共识[J].中华结核和呼吸杂志,2018,41(6):409—446.

[10]陈轶坚.多黏菌素类合理应用国际共识指南[J].中国感染与化疗杂志,2019,19(4):460—463.

文章来源:韩竺杭,刘玥,李文利,等.用LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中多黏菌素B和替加环素的浓度[J].中国临床药理学杂志,2024,40(07):1049-1053.