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埃克替尼对肺动脉高压大鼠右心室重构的保护作用

2024-06-28 69 上传者：管理员

摘要：目的研究埃克替尼对野百合碱(MCT)诱导的肺动脉高压(PH)大鼠右心室重构的影响。方法将SD大鼠随机分为对照组(0.3%羧甲基纤维素钠)、模型组和低、高剂量实验组(30、60 mg·kg-1埃克替尼),每组8只。模型组和低、高剂量实验组单次腹腔注射60 mg·kg-1 MCT建立大鼠肺动脉高压模型。MCT注射后连续给药4周。检测各组大鼠血流动力学指标，以原位末端标记法(TUNEL)染色检测右心室细胞凋亡情况，以蛋白质印迹法检测右心室B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的胱天蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸化EGFR(p-EGFR)、视神经萎缩症蛋白1(Opa1)和线粒体融合蛋白2(Mfn2)的蛋白表达情况。结果低、高剂量实验组和对照组、模型组右心室收缩压分别为(38.58±4.98)、(34.15±3.88)、(23.66±2.45)和(45.07±5.78)mmHg;平均肺动脉压分别为(27.85±3.77)、(24.25±3.09)、(17.33±2.46)和(33.07±4.15)mmHg;右心室/(左心室+室间隔)分别为(36.38±5.51)%、(33.63±4.69)%、(22.25±2.96)%和(42.50±7.33)%;右心室/胫骨长度分别为(69.33±7.86)、(62.69±7.17)、(49.12±6.42)和(78.22±9.07)mg·cm-1。低、高剂量实验组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01)。低、高剂量实验组Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、p-EGFR、Opa1、Mfn2与模型组相比，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论埃克替尼能够抑制MCT诱导的PH大鼠右心室重构，其机制可能与其降低右心室p-EGFR水平、缓解线粒体功能紊乱、抑制心肌细胞凋亡有关。

关键词：
pH
右心室重构
埃克替尼
线粒体功能障碍
表皮生长因子受体
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肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH)是一种以肺血管重塑、肺血管阻力升高、右心室后负荷增加和右心衰竭为特征的进行性疾病[1]。目前临床治疗PH的药物主要包括前列腺素类、内皮素-1拮抗药和磷酸二酯酶抑制药，但这些药物不能彻底治愈该病[2]。右心衰竭是导致PH高死亡率的重要因素，因此抑制右心室重构、预防右心衰竭被认为是治疗PH的有效策略之一[3]。埃克替尼是我国自主研发的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)-酪氨酸激酶抑制药，可抑制肿瘤血管生成、增殖和转移，临床用于晚期非小细胞肺癌的治疗[4]。但近期研究发现，埃克替尼对PH肺血管重构具有一定的抑制作用[5]。本实验以野百合碱(monocrotaline, MCT)诱导的PH右心室重构为模型，探讨埃克替尼对右心室重构的保护作用。

一、材料与方法

1 材料

动物7～8周龄SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量(220±20)g, 购自塞业(苏州)生物科技有限公司。动物生产许可证号：SCXK(苏)2022-0016。本实验经皖南医学院动物伦理委员会批准(批号：LLSC-2022-052)。

药品与试剂盐酸埃克替尼片，规格：每片125 mg, 批号：A230403,批准文号：国药准字H20110061,杭州贝达药业股份有限公司生产；MCT,规格：每支1 g, 纯度：98.08%,批号：315-22-0,购自美国Sigma公司。免疫组化试剂盒，购自北京百奥莱博科技有限公司；B细胞淋巴瘤2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、裂解的胱天蛋白酶-3(cleaved cysteine aspartic acid specific protease-3,cleaved-caspase-3)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 抗体及原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)染色试剂盒，均购自上海碧云天生物技术有限公司；视神经萎缩症蛋白1(optic atrophy 1, Opa1)和线粒体融合蛋白2(mitofusin 2, Mfn2)抗体，购自美国Abcam公司；表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)和磷酸化EGFR(phosphorylated EGFR,p-EGFR)抗体，均购自美国Santa Cruz公司。

仪器HistoCore石蜡切片机，德国Leica公司产品；GE Amersham Imager 600自动化学发光凝胶成像分析仪，美国通用电气公司产品；BL-420A生物信号采集与分析系统，成都泰盟软件有限公司产品。

2 实验方法

2.1 实验分组与给药

将SD大鼠随机分为对照组、模型组和低、高剂量实验组，每组8只。模型组单次腹腔注射60 mg·kg-1 MCT建立大鼠肺动脉高压模型，低、高剂量实验组在MCT注射当天开始连续灌胃给予30、60 mg·kg-1 埃克替尼，对照组和模型组灌胃给予等体积的0.3%羧甲基纤维素钠溶液。给药4周处理动物，进行相关指标检测。

2.2 右颈外静脉插管法检测血流动力学指标[6]6]

大鼠经腹腔注射400 mg·kg-1三溴乙醇麻醉后，将聚乙烯导管经右颈外静脉插入右心室及肺动脉，用BL-420A生物信号采集与分析系统分别记录右心室收缩压(right ventricular systolic pressure, RVSP)和平均肺动脉压(mean pulmonary artery pressure, mPAP)。随后处死动物，将右心室(right ventricle, RV)游离壁与左心室及室间隔(left ventricle + septum, LV+S)分离并称质量，同时测量大鼠胫骨长度(Tibial length),计算RV/LV+S比值和RV/Tibial length比值。

2.3 HE染色法检测右心室病理变化

组织用4%多聚甲醛固定后，根据前期实验方法[7]进行HE染色，光镜下观察右心室病理变化。

2.4 TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡[8]8]

石蜡切片脱蜡至水，根据TUNEL染色试剂盒说明书进行染色，光镜下观察右心室心肌细胞凋亡情况。

2.5 蛋白质印迹法检测相关蛋白指标

低温条件下提取右心室蛋白，用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。参照前期的研究方法[7]进行蛋白质印迹检测。相关一抗稀释浓度分别为Bcl-2(1∶2 000)、Bax(1∶2 000)、cleaved-caspase-3(1∶2 000)、EGFR(1∶1 000)、p-EGFR(1∶500)、Opa1(1∶500)、Mfn2(1∶500)及GAPDH(1∶3 000)。相应HRP标记的山羊抗小鼠或HRP标记的山羊抗兔二抗稀释浓度(1∶2 000～1∶4 000)。用Image J 1.52软件进行灰度值测量并统计分析蛋白相对表达水平。

3 统计学处理

用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，用one-way ANOVA及SNK-q检验方法进行统计分析。

二、结果

1 埃克替尼对MCT诱导的PH大鼠血流动力学和肺血管重构的影响

模型组单次腹腔注射60 mg·kg-1 MCT建立大鼠肺动脉高压模型，低、高剂量实验组在MCT注射当天开始连续灌胃给予30、60 mg·kg-1 埃克替尼，对照组和模型组灌胃给予等体积的0.3%羧甲基纤维素钠溶液。

与对照组相比，模型组大鼠RVSP和mPAP均显著升高(均P<0.01)。与模型组相比，低、高剂量实验组大鼠RVSP和mPAP均显著降低(均P<0.01),见表1。

表1 盐酸埃克替尼对野百合碱(MCT)诱导的肺动脉高压(PH)大鼠右心室收缩压(RVSP)和平均肺动脉压(mPAP)的影响

2 埃克替尼对MCT诱导的PH大鼠右心室重构的影响

HE染色结果显示，对照组大鼠心肌细胞排列规则、整齐，细胞间隙较小；模型组心肌细胞肥大，排列紊乱，心肌纹理模糊，细胞间隙增大。而低、高剂量实验组上述病理损伤均有不同程度改善。与对照组相比，模型组平均心肌肥厚指标的右心室肥厚指数(RV/LV+S、RV/Tibial length)均明显升高(均P<0.01)。与模型组相比，低、高剂量实验组右心室肥厚指数均显著降低(均P<0.01),见表2。

3 埃克替尼对MCT诱导的PH大鼠右心室心肌细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果发现，对照组右心室未见心肌细胞凋亡，但模型组与对照组比较心肌细胞凋亡的数量显著增加，而低、高剂量实验组与模型组比较凋亡的心肌细胞数显著减少。蛋白质印迹检测发现，与对照组比较，模型组抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下调，而促凋亡相关蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表达均显著上调(均P<0.01),但与模型组相比，低、高剂量实验组Bcl-2的表达均显著上调，而Bax和cleaved-caspase-3的表达均显著下调(P<0.05,P<0.01),见表3。

表2 埃克替尼对MCT诱导的PH大鼠右心室肥厚指数的影响

4 埃克替尼对MCT诱导的PH大鼠右心室线粒体功能障碍的影响

与对照组比较，模型组p-EGFR/EGFR显著升高，线粒体功能蛋白Opa1和Mfn2的表达均显著下降(均P<0.01)。与模型组比较，p-EGFR/EGFR显著下降，线粒体功能蛋白Opa1和Mfn2的表达均显著升高(P<0.05,P<0.01),见图1和表4。

表3 埃克替尼对MCT诱导的PH大鼠右心室B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、裂解的胱天蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)蛋白表达的影响

表4 埃克替尼对MCT诱导的PH大鼠右心室磷酸化表皮生长因子受体(p-EGFR)/EGFR、视神经萎缩症蛋白1(Opa1)和线粒体融合蛋白2(Mfn2)蛋白表达的影响

三、讨论

PH是一种以进行性肺动脉压和血管阻力升高为特征的恶性心肺血管疾病。血管重构和右心室重构是肺动脉高压的主要病理特征；肺血管重构往往导致肺血管阻力和压力持续升高，从而增加右心室后负荷，诱发右心室重构[9]。前期研究发现，埃克替尼能够减轻MCT诱导的PH大鼠肺血管重构[5]。本研究不仅发现埃克替尼给药4周后，PH大鼠RVSP和mPAP明显降低，肺血管重构显著减轻，还发现PH大鼠右心室重构明显缓解。

EGFR是ErbB受体酪氨酸激酶家族的成员，是肿瘤生物学中研究最广泛的分子之一[10]。但近年研究证实，EGFR信号通路过度激活不仅参与了PH肺血管重构，还参与了心肌重构[5,11]。而体内外实验发现抑制EGFR的过度磷酸化能够缓解血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥厚和自发性高血压大鼠心肌纤维化[12]。EGFR信号通路过度激活参与了线粒体功能的紊乱，而线粒体功能紊乱与心肌肥厚密切相关[13]。有研究发现，抑制线粒体功能紊乱能够缓解低氧诱导的PH大鼠心肌肥厚[14]。而本研究发现，埃克替尼能够明显抑制MCT诱导的右心室EGFR的过度磷酸化，显著降低线粒体功能紊乱(线粒体结构损伤明显减轻，线粒体功能蛋白Opa1和Mfn2的表达明显升高),明显上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达而显著下调促凋亡相关蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表达，显著减轻心肌细胞的凋亡。

埃克替尼能够缓解MCT诱导的PH大鼠右心室重构，其机制可能与其抑制EGFR的磷酸化，降低线粒体功能紊乱，缓解心肌细胞凋亡有关。

基金资助:安徽省高校自然科学研究重大基金资助项目(KJ2021ZD0106); 安徽省高校自然科学研究重点基金资助项目(2023AH053200);

文章来源:胡霞,顾文强,严静静,等.埃克替尼对肺动脉高压大鼠右心室重构的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(12):1784-1788.