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基于转录组学数据的抗高尿酸血症肾病药物的预测和活性验证

2024-07-29 58 上传者：管理员

摘要：目的运用转录组学数据从现有药物中筛选可用于抗高尿酸血症肾病（hyperuricemic nephropathy, HN）的小分子药物，为HN的治疗提供新思路。方法从GEO数据获得HN数据集，筛选获得差异表达基因；通过Metascape平台对核心靶点进行KEGG和GO富集分析；采用String数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）,Cytoscape计算节点连接度筛选HN发病核心基因；CMAP(connectivity map)数据库中预测抗HN药物，分子对接分析候选药物与核心靶点之间的相互作用；氧嗪酸钾联合腺嘌呤建立HN模型，验证候选药物的肾保护功能。结果从HN转录组数据集GSE190205，共筛选获得557个差异表达基因，其中上调基因374个，下调基因183个，差异基因涉及类风湿性关节炎、脂肪酸降解、TNF信号通路、吞噬小泡等信号通路，ITGAM、TLR2、CD68、CD44和CCL5等基因可能参与HN的发病；通过CMAP分析，筛选到M-3M3FBS、恩扎妥林、白桦脂酸和恩替卡韦等候选药物，进一步动物实验证实恩扎妥林具有良好的肾保护功能，降低HN大鼠的肾脏指数，血清肌酐和尿素氮显著降低（P <0.05或P <0.01），改善肾组织损伤。结论基于转录组学数据的“药物重定位”策略可从现有药物中筛选到有效的抗HN药物，为HN药物的研究提供了新思路。

关键词：
CMAP
恩扎妥林
药物重定位
转录组
高尿酸血症肾病
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随着现代生活方式的变化，高尿酸血症已经成为全球范围内越来越普遍的代谢性疾病，其发病率不断上升。高尿酸血症不仅与痛风密切相关，同时，长期的高尿酸水平也被认为是引发多种肾脏疾病的重要因素之一[1]。高尿酸血症肾病（hyperuri‐cemic nephropathy,HN）作为高尿酸血症的并发症，对患者的健康构成了严重威胁。目前治疗HN的药物主要有别嘌醇、苯溴马隆和地塞米松等[2]，上述药物存在副作用较大、不适合长时间服用等问题，因此继续开发新型、有效的HN治疗药物，仍是本领域研究的迫切任务。

“药物重定位”是一种重要的药物研发策略，通过探索现有药物或化合物的新用途，加速新治疗方法的发现和开发过程，可以显著降低药物研发的时间和成本。目前“药物重定位”的策略已应用于多个疾病领域，如肿瘤、罕见疾病、神经系统疾病和传染病等。例如，三氟拉嗪是一种抗精神病药物，Kang等[3]研究发现三氟拉嗪同系物3 dc是一种潜在的抗胶质母细胞瘤药物，阿司匹林是经典的解热镇痛药物，Liu等[4]研究发现奥斯替尼和阿司匹林联合应用可以显著延长EGFR突变非小细胞肺癌患者的生存期。这些案例表明了“药物重定位”策略在新药物发现方面的潜力。

本研究通过分析HN转录组数据获得其中的关键基因，采用依托CMAP(connectivity map）工具的“药物重定位”策略预测HN的新治疗分子，并进一步在动物模型上验证相关分子的治疗效果，以期为HN的治疗提供潜在的新治疗药物，为相关药物的研发提供新思路。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

肌酐（Cr）试剂盒（C013-2-1，南京建成生物工程研究所）；尿素氮（BUN,C011-2-1，南京建成生物工程研究所）；苏木素-伊红染液（D006，南京建成生物工程研究所）；别嘌醇片（H44021695，广州康和药业有限公司）；腺嘌呤（A108804，上海阿拉丁生化科技有限公司）；氧嗪酸钾（P831461，上海麦克林生化科技有限公司）。

1.1.2 实验动物

SD雄性大鼠36只，体质量18～22 g,SPF级，购于广东省医学实验动物中心，生产许可证号SCXK（粤）2022-0002，正式实验室前适应性喂养1周。本实验严格遵守动物福利伦理与保护规定，并已获得广东药科大学动物伦理委员会批准，批准号为SPF2017660。

1.2 方法

1.2.1 HN差异基因的筛选和分析

在Gene Expression Omnibus 数据库中，以“Hyperuricemic Nephropathy”为关键词，检索HN转录组数据。以〡log2FC〡>1和P<0.01为截断值筛选HN差异表达基因。通过Metascape平台对差异表达基因进行KEGG和GO(Gene ontology）富集分析[5]。采用String数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI),Cytoscape 3.7.1软件对PPI进行可视化分析，通过计算节点连接度（degree）筛选其中的核心基因。

1.2.2 HN治疗小分子的预测

在CMAP数据库中进入“Query”模块，选择Gene expression(L1000）模式，各输入150个上调基因和下调基因，进行药物表达谱与疾病表达谱关联分析。输出结果中连通度分数越接近-100，表明药物的治疗HN的潜力越大。

1.2.3 恩扎妥林（enzastaurin）与核心基因的分子对接

小分子化合物的SDF文件从PubChem数据库下载获取。核心基因编码蛋白的3D结构分别从PDB数据库和Alphafold数据库获得。以小分子化合物为配体，核心蛋白为受体，使用Discovery Studio 2019软件进行分子对接，计算小分子化合物和核心蛋白的LibDockScore评分。

1.2.4 恩扎妥林对HN大鼠肾功能的影响

将大鼠随机分为对照组、模型组、阳性组、恩扎妥林高剂量组、恩扎妥林中剂量组和恩扎妥林低剂量组，除对照组外，各组大鼠每日灌胃1.5 g/kg氧嗪酸钾和50 mg/kg腺嘌呤，连续6周[6]。建模第0周开始给药，对照组和模型组给予等量生理盐水，阳性组给予5 mg/kg别嘌醇，恩扎妥林不同剂量组分别给予10、20、40 mg/kg药物。末次给药12 h后处死大鼠，分离血清，测定血清，试剂盒法测定BUN和Cre，分离肾脏，测定肾脏指数，取肾固定于多聚甲醛24 h，常规石蜡切片，HE染色观察组织病理学变化。

1.2.5 统计和分析

所有实验数据以均数±标准差表示，使用SPSS 18.0进行统计分析，Adobe Illus‐trator CC2019和Graphpad Prism 8.0绘图，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 HN差异基因的筛选

从GEO数据库中获得一个HN转录组数据集GSE190205，并通过RMA算法对矩阵数据归一化，以〡log2FC〡>1和P<0.01为截断值筛选HN差异表达基因，共筛选获得557个差异表达基因，其中上调基因374个，下调基因183个（见图1）。

图1 HN差异表达基因火山图

2.2 HN差异表达基因的功能注释

HN差异表达基因富集分析结果显示，生物学过程条目主要集中于先天免疫反应（innate immune response）、炎症反应（inflammatory response）和适应性免疫反应（adaptive immune response）等，细胞组分条目过程主要集中于细胞外基质（extracellular matrix）、质膜外侧（external side of plasma membrane）和胶原三聚体（collagen trimer）等，分子功能条目主要集中于糖胺聚糖结合（glycosaminoglycan binding）、细胞因子活性（cytokine activity）和细胞外基质结构成分（extracellular matrix structural constituent）等（见图2）。KEGG结果显示表达基因在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis）、脂肪酸降解（Fatty acid degradation）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、吞噬小泡（phagosome）和色氨酸代谢（tryptophan metabolism）相关的代谢通路显著富集，如图3所示。

运用String平台构建HN差异表达基因蛋白互作网络，利用Cytoscape软件对网络可视化，如图4所示。Degree值排名前10的基因为ITGAM（上调）、TLR2（上调）、CD68（上调）、CD44（上调）、CCL5（上调）、CCL2（上调）、APOE（上调）、ADGRE1（上调）、FN1（上调）和ITGAX（上调），上述基因为HN发病中的潜在核心基因。

2.3 治疗HN的药物预测

为了预测治疗HN的药物，采用CMAP软件从临床治疗药物中预测潜在的治疗药物。评分排名前10的药物分别为M-3M3FBS、恩扎妥林、白桦脂酸、恩替卡韦、SU-11274、右啡烷、环丙孕酮、西尼地平、柠檬苦素和SB-202190。其中白桦脂酸、恩替卡韦、SU-11274、右啡烷、环丙孕酮、西尼地平、柠檬苦素和SB-202190均为文献报道的具有肾保护或缓解纤维化的小分子化合物，表明本实验的结果具有可靠性。恩扎妥林为PKC抑制剂，评分排在第2，本研究选择恩扎妥林进行生物活性验证（见表1）。

2.4 恩扎妥林与核心蛋白的分子对接

以恩扎妥林为配体，核心蛋白作为受体，进行分子对接分析。结果显示，恩扎妥林与Adhesion G proteincoupled receptor E2、Toll-like receptor 2、Monocyte chemotactic protein 1、CD44 antigen的LibDockScore均大于90（见表2),LibDockScore≥90表明配体与受体具有较强的亲和力，使得配体更容易结合，进一步分析显示恩扎妥林可能与上述蛋白均可产生较多的氢键、碳氢键、常规氢键和范德华力等（见图5），提示这些蛋白可能是恩扎妥林的作用靶点。

图2 HN差异表达基因的GO富集分析

图3 HN差异表达基因KEGG富集分析

nephropathy

2.5 恩扎妥林对HN大鼠肾功能的影响

2.5.1 恩扎妥林对HN大鼠肾脏指数、Cr和BUN的影响

如图6所示，与对照组比较，模型组肾脏指数、血清Cre和BUN显著升高（P<0.01），与模型组比较，阳性组、恩扎妥林高剂量、中剂量和低剂量组肾脏指数、血清Cre、BUN显著降低（P<0.01或P<0.05）。

2.5.2 恩扎妥林对HN大鼠肾组织的影响

如图7所示，对照组大鼠肾小球结构完整，肾间质正常，肾小囊腔内未见异常物质。与对照组比较，模型组大鼠肾脏存在肾小管扩张，肾小球萎缩，肾小管上皮细胞坏死、脱落等现象。与模型组相比，各给药组均能一定程度改善肾损伤，肾小管扩张、上皮细胞坏死、脱落现象减少，肾小管边缘界限更为完整清晰。

图4 HN差异表达基因核心基因筛选

表1 利用CMAP数据库鉴定的治疗HN的候选小分子化合物

表2 恩扎妥林与核心蛋白的结合能

图5 恩扎妥林与ADGRE1、TLR2、CCL2、CD44的分子对接

图6 恩扎妥林对HN大鼠肾指数、血清Cre和BUN的影响

图7 HE染色观察各组大鼠肾脏的病理变化

3、讨论

通过转录组学分析和蛋白质相互作用（PPI）网络分析，预测发现一系列可能是HN发病核心靶点，包括ITGAM、TLR2、CD68、CD44、CCL5、CCL2、APOE、ADGRE1、FN1和ITGAX等。以往的研究已报道高尿酸血症会导致肾小管损伤以及肾脏间质纤维化，可见FN1显著表达上调[15],CCL2和CCL5水平的升高，可通过趋化单核细胞向炎症部位迁移引起慢性尿酸性肾损伤[16-17]。Cxcl10是CXC趋化因子家族成员，可介导Thl型炎症。CD68是巨噬细胞的生物标志物，巨噬细胞在肾脏疾病中有致炎症和纤维化作用[18]。APOE在HN中的作用尚不清楚，但是APOE E4与原发性高尿酸血症的风险具有一定的关联性[19]。至于ITGAM、ADGRE1、CD44和ITGAX等在HN中的作用，目前尚无相关报道，提示需要进一步深入探究它们在发病机制中的作用。

CMAP是一种利用基因表达数据来发现药物、基因和疾病之间潜在联系的生物信息学工具[20]。在“药物重定位”研究中，CMAP发挥着重要作用。如果一个药物能够产生与某疾病相反的基因表达改变，这表明该药物可能具有治疗该疾病的潜力[21]。基于上述原理，通过比较不同条件下的基因表达模式，CMAP可以预测药物对新疾病的潜在疗效。神经母细胞瘤（NB）是最致命的儿科癌症之一，在Paolo Uva等[22]的研究中，采用CMAP分析了神经母细胞瘤中差异表达基因，发现PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂是用于治疗NB的新候选化合物。在ChuehChuan Yen的研究中，将胃肠道间质瘤细胞系的ETV1敲除基因特征上传到模式匹配软件CMAP中，探索靶向ETV1的潜在药物，实验结果发现精神病药物吩噻嗪通过诱导胃肠道间质瘤细胞凋亡和自噬发挥抗肿瘤作用[23]。

本研究中，利用获得的HN转录组差异基因，通过CMAP预测了多个潜在的抗HN药物。进一步通过文献调研发现，上述多个化合物具有肾保护功能或抗纤维化作用，验证了本实验结果的可靠性，如白桦脂酸可以逆转腺嘌呤诱导的慢性肾病大鼠的肾纤维化，柠檬苦素能通过激活ERK2，能显著改善缺血性急性肾损伤后的肾功能。恩扎妥林是一种口服丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，可选择性靶向PKC-β和PI3/AKT信号通路[24]，是一种有前景的抗癌药物，临床前的体内外研究均表明，恩扎妥林对结肠癌、淋巴瘤癌、多发性骨髓瘤和非小细胞肺癌均具有抗癌活性[25]。目前尚无研究报道恩扎妥林在HN在中的应用。HN发病机制中，高尿酸通过激活PI3/AKT信号通路[26]，上调多种炎性细胞因子、趋化因子和生长因子的表达，在尿酸致肾脏炎性损伤中发挥了关键作用[27]，因此恩扎妥林是一种潜在的治疗HN药物。为了考察恩扎妥林的抗HN活性，用氧嗪酸钾和腺嘌呤建立了HN大鼠模型，结果显示恩扎妥林可显著改善模型大鼠的肾功能，降低肾脏指数、血清Cre、BUN，改善肾组织病理学变化。

综上所述，本研究利用HN表达谱数据集，通过生物信息学的方法筛选出HN发病中的关键表达基因，在此基础上，基于“药物重定位”策略寻找治疗HN候选药物，并采用体内实验验证了恩扎妥林的抗HN活性。

参考文献:

[1]张奎,邓向亮,傅南琳.肠道菌群与痛风性关节炎的研究进展[J].广东药科大学学报, 2020, 36(6):903-906.

[16]苗盛杰.基于生物信息学的高尿酸血症诱导慢性肾损伤相关基因分析[D].长春:吉林大学, 2024.

[17]邓正泊,蒋廷旺,钱建平.慢性尿酸性肾病患者血清趋化因子配体2的表达及其临床意义[J].中国基层医药, 2016(20):4.

[18]包瑾芳.自噬在高尿酸血症肾损害中的作用及3-MA干预机制初步探讨[D].上海:上海交通大学, 2019.

基金资助:广州市基础与应用基础研究项目(202201010357); 广东省医学科学技术研究基金资助项目(A2022069); 广东省中医药局中医药科研基金资助项目(20232086);

文章来源:王丽君,刘文彬.基于转录组学数据的抗高尿酸血症肾病药物的预测和活性验证[J].广东药科大学学报,2024,40(04):115-122.