我国中老年人群致死､残障的首位病因是缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke,CIS),具有发病率高､进展快､死亡和致残率高等特点[1-2]｡CIS患者由于血管栓塞或狭窄,导致脑细胞反复坏死,引发炎症､氧化应激,从而损伤脑组织神经元,再次恢复血液灌流后出现炎症级联反应,神经元凋亡加重,即脑缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I-R)损伤[3]｡氧化应激被证实与脑I-R的发生密切相关｡Kelch样ECH关联蛋白1(Kelch-like echassociated protein 1,Keap1)/核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid2 related factor 2,Nrf2)通路被广泛认为是维持细胞氧化还原稳态的防御系统[4]｡脑卒中属于“中风”的范畴,病因多为瘀血阻络造成｡银杏内酯成分具有活血通经､化瘀活络功效,用于CIS治疗,作用机制可能与Nrf2激活有关,减轻神经缺损症状[5-6]｡本研究通过采用银杏内酯治疗临床CIS患者的效果分析以及对I-R大鼠的干预治疗,研究其抗氧化应激,改善I-R损伤的具体机制｡

1、资料与方法

1.1 临床研究

1.1.1 一般资料

选择安徽医科大学第一附属医院北区住院部2022年1月至2023年9月的60例CIS患者,按照随机数字表法划分观察组和对照组,各30例｡观察组:男20例,女10例;年龄49~87岁,平均(70.2±11.19)岁;对照组:男22例,女8例;年龄35~87岁,平均(70.27±12.51)岁｡两组患者性别､年龄比较,具有可比性(P>0.05)｡本研究经患者同意并通过医院伦理委员会批准(批号:2019AH-26)｡

1.1.2 纳入与排除标准

纳入标准:所有患者符合高危非致残性缺血性脑血管病事件(high-risknondisabling ischemic cerebrovascular events,HR-NICE)的诊断标准[7],发病时症状对应的脑中部位与头颅CT､MRI检查显示病变范围一致｡排除标准:合并其他系统疾病或急重症患者,如恶性肿瘤或颅内出血｡

1.1.3 方法

对照组患者予抗血小板药物(阿司匹林肠溶片/氯吡格雷),联合调脂稳斑､降血压､神经功能保护药物等,控制原发疾病,预防脑水肿及并发症｡观察组以对照组为基础,予银杏内酯注射液(成都百裕制药,批号:Z20110035,2毫升/支)10 mL静滴,一天一次,10 d为一个疗程｡

1.2 动物实验

1.2.1 实验动物及分组

7~8周龄SPF级雄性SD大鼠40只,体质量(200±20)g[邳州市东方养殖有限公司,SCXK(苏)2022-0005],采用随机数字表法将大鼠分为模型组[大脑中动脉栓塞法(MCAO)造模共使用大鼠30只,其中20只造模成功]和假手术组(10只,NC组),再将造模成功后的20只大鼠随机分为模型组和银杏内酯组,每组10只｡

1.2.2 动物模型制备及干预方法

参照改良ZeaLonga线栓法,制备MCAO大鼠模型[8]｡1.5%戊巴比妥钠(2 mL/kg)腹腔注射麻醉,在大鼠颈部正中作一切口,将右侧颈总动脉､颈内动脉和颈外动脉分离并暴露出来,结扎颈内动脉近心端,夹闭颈内动脉远心端｡然后在颈内动脉近心端作一小切口,将套管针插入后,置入栓线,轻拉颈内动脉调整插入方向,松开动脉夹,继续插入栓线,阻断大脑中动脉血液供应;缺血60 min后,取下线栓,恢复血流实现再灌注｡最后切口消毒,予以缝合｡在NC组中进行了血管分离,但不做结扎和线栓处理｡造模2 h后,观察其神经功能状态,当大鼠出现站立不稳､左侧肢体偏瘫､提尾向一侧转圈等表现,即为造模成功[9],然后开始给药处理｡根据人与大鼠体表面积比进行剂量换算,NC组和模型组给予生理盐水腹腔注射,银杏内酯组给予2.5 mg/kg银杏内酯注射液腹腔注射,1次/天,连续给药14天,末次给药2 h后取材｡

1.3 药物与试剂

银杏内酯注射液(成都百裕制药,批号:Z20110035,2毫升/支);一抗Nrf2(货号ab92946)购于abcam公司;一抗Keap1(60027-1-Ig)､β-actin(81115-1-RR)均购于Proteintech公司;Rat IL-6ELISA kit(ER20298M)､Rat TNF-α ELISA kit(ER20497M)购于上海威奥生物;Rat IL-2 ELISA kit(ELK1151)购于武汉科鹿生物;人外周血单核细胞(pe⁃ripheral blood mononuclear cell,PBMC)分离试剂盒和大鼠PBMC分离试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司(P9011,P9160)｡

1.4 仪器

全波长酶标仪(无锡华卫德朗DR-200Bc);化学发光成像系统(杭州申花科技有限公司SH-523);电泳系统(Bio-RAD公司Mini-Proten Tetra System);CFXTouch实时荧光定量PCR仪(美国BioRad公司ABI-7500)｡

1.5 检测指标及方法

1.5.1 临床研究

(1)神经功能评价:治疗前后的神经功能缺损状况采用美国国立卫生研究院脑卒中量表(National Institute of Health stroke scale,NIHSS)进行评估[10],包含11个项目,0~42分,分值与神经功能障碍呈正相关｡(2)临床疗效评价:参考NIHSS评分制定疗效判定标准[10]｡基本痊愈:临床症状消失,NIHSS评分减少>90%;显效:临床症状好转明显,NIHSS评分减少46%~90%;有效:临床症状改善,NIHSS评分减少18%~45%;无效:临床症状无明显变化,NIHSS评分减少<18%｡总有效率=(总例数-无效例数)/总例数×100%｡(3)日常生活活动能力评估:治疗前后的日常生活活动能力用Barthel指数(the Barthel index of ADL)进行评估[11]｡Barthel指数的记分区间为0~100分｡分数越高,即表示日常生活活动能力越好｡(4)Realtime PCR检测外周血PBMC细胞中Nrf2､Keap1 mRNA表达水平:治疗前､后抽取患者静脉血5 mL｡将EDTA抗凝血与生理盐水1∶1混匀,混匀后加入等体积Ficoll细胞分离液,按照说明书提取PBMC细胞,Trizol法提取总RNA,将一定量RNA反转录为cDNA｡RT-qPCR仪检测PBMC细胞中Nrf2､Keap1 mRNA水平｡反应条件为:95℃,30 s;95℃,5 s;60℃,34 s,40个循环｡Nrf2､Keap1与内参β-actin的引物序列见表1,其相对表达水平采用2-△△CT法进行定量分析｡(5)Western blot检测外周血PBMC细胞中Nrf2､Keap1蛋白水平:治疗前､后抽取患者静脉血5 mL｡提取蛋白,BCA法测定蛋白浓度,蛋白变性,SDS-PAGE凝胶电泳,转膜,封闭,4℃过夜孵育一抗(Keap1 1∶2 000,Nrf2 1∶1 000,β-actin 1∶10 000),洗涤,孵育,加入二抗,室温孵育1 h,洗涤,曝光显影｡以目的条带和β-actin条带的灰度值比值表示Nrf2､Keap1蛋白的水平｡

1.5.2 动物实验

(1)神经功能评分的测定:根据Zea-Longa评分系统[9,12]进行神经功能评分,0分:无神经功能障碍,1分:不能伸展对侧前爪,2分:走路时转向偏瘫侧,3分:向偏瘫侧倾倒,4分:无法自主行走,失去知觉｡(2)HE染色观察脑组织病理变化:大鼠脑组织用10%多聚甲醛固定,经过石蜡包埋､切片后进行HE染色,观察脑组织病理变化｡(3)TTC染色检测脑梗死体积百分率:取出脑组织,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗并切成2 mm厚的切片,将切片使用2%TTC染液进行染色,正常与梗死区域以红白颜色区分,Image J软件计算其梗死比例,脑梗死体积百分率(%)=(脑梗死体积/全部脑体积)×100%｡(4)ELISA检测细胞因子水平:按照ELISA试剂盒说明,检测脑组织匀浆和血清中TNF-α､IL-2､IL-6表达水平｡(5)Real-time PCR检测大鼠脑组织及PBMC细胞中Nrf2､Keap1 mRNA表达水平:提取各组大鼠脑组织及PBMC细胞中总RNA,检测浓度及纯度,样品合格(OD280/OD260=1.7~2.0)后反转录成cDNA｡RT-qPCR仪检测大鼠脑组织及PBMC细胞中Nrf2､Keap1 mRNA水平｡Nrf2､Keap1与内参β-ac⁃tin的引物序列见表1,其相对表达水平采用2-△△CT法进行定量分析｡(6)Western blot检测大鼠脑组织及PBMC细胞中Nrf2和Keap1蛋白表达:使用裂解缓冲液提取各组大鼠脑组织及PBMC细胞的蛋白,同时使用BCA试剂盒测定蛋白浓度｡各组取50μg蛋白样本配制上样缓冲液,煮沸8 min后,SDS-PAGE电泳分离蛋白,然后湿法转膜,使用缓冲液封闭1 h,一抗(Keap11∶2 000,Nrf2 1∶1 000,β-actin 1∶10 000),4℃孵育过夜,TBST洗涤,加入二抗,室温孵育1 h,TBST洗膜,系统成像,Image J软件评估目的蛋白灰度值｡

表1 Real-time PCR引物

1.6 统计学方法

采用SPSS 25.0软件统计分析,正态分布计量资料用±s表示,两组间均数比较用t检验,多组比较用单因素方差分析;偏态分布计量资料用M(P25,P75)表示,多组比较用非参数检验｡计数资料以例或百分比表示,组间比较用χ2检验｡以P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1 临床研究

2.1.1 两组NIHSS评分比较

治疗前,两组NIHSS评分差异无统计学意义(P>0.05)｡治疗后,两组NIHSS评分均较治疗前降低(P<0.05),与对照组比较,观察组NIHSS评分降幅更明显(P<0.05)｡见表2｡

表2 两组治疗前后NIHSS评分比较M(P25,P75)

注:NIHSS为美国国立卫生研究院脑卒中量表｡

2.1.2 两组临床疗效比较

观察组总有效率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)｡见表3｡

表3 两组临床疗效比较[例(%)]

2.1.3 两组治疗前后Barthel指数比较

治疗前,两组Barthel指数比较,差异无统计学意义(P>0.05)｡治疗后,两组Barthel指数均较治疗前提高(P<0.01),观察组Barthel指数升幅较对照组更明显(P<0.01)｡见表4｡

表4 两组治疗前后Barthel指数比较(±s)

注:Barthel指数为日常生活活动能力指数｡

2.1.4 两组治疗前后人PBMC细胞中Keap1和Nrf2mRNA及蛋白表达比较

治疗前,两组Keap1和Nrf2mRNA及蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)｡治疗后,两组Keap1mRNA及蛋白表达较治疗前降低,Nrf2mRNA及蛋白表达较治疗前升高(P<0.05);与对照组比较,观察组治疗前后Keap1蛋白表达降幅更明显,Nrf2mRNA及蛋白表达升幅更明显(P<0.01)｡见表5,图1｡

2.2 动物实验

2.2.1 银杏内酯对MCAO大鼠神经功能的影响

NC组神经功能评分为0分,模型组神经功能评分平均为2.70(2.75,2.60)分,银杏内酯组神经功能评分平均为0.80(0.95,0.80)分,3组间神经功能评分差异均具有统计学意义(χ2=7.513,P=0.023),银杏内酯组较模型组神经功能评分显著降低(t=-13.250,P<0.01)｡

2.2.2 银杏内酯对MCAO脑组织病理学的影响

NC组大鼠海马区神经元细胞结构正常,细胞核圆润,排列清晰｡模型组较NC组大鼠可见异性细胞,部分细胞核皱缩､坏死,排列紊乱;银杏内酯组较模型组大鼠神经细胞的损伤程度恢复,细胞排列更整齐,核固缩减少,细胞核逐步增大变圆｡见图2｡

2.2.3 银杏内酯对MCAO大鼠脑梗死体积百分率的影响

NC组未见梗死灶,模型组大鼠脑梗死体积百分率为(27.13±12.43)%,银杏内酯组脑梗死体积百分率为(13.23±8.98)%,3组间梗死体积百分率差异具有统计学意义(F=11.221,P=0.004),银杏内酯组较模型组梗死体积百分率下降,但差异无统计学意义(Z=-1.776,P=0.076)｡见图3｡

2.2.4 银杏内酯对MCAO大鼠细胞因子的影响

NC组与模型组､银杏内酯组的炎性细胞因子水平差异均具有统计学意义(P<0.01),与模型组比较,银杏内酯组大鼠脑组织匀浆及血清中炎性因子TNF-α､IL-2和IL-6表达均明显下调(P<0.01)｡见表6｡

表5 人PBMC细胞中Keap1､Nrf2mRNA及蛋白表达比较(±s)

注:Keap1为Kelch样ECH关联蛋白1,Nrf2为核因子E2相关因子2｡

图1 两组PBMC细胞Keap1､Nrf2蛋白免疫印迹

注:A为对照组治疗前,B为对照组治疗后,C为观察组治疗前,D为观察组治疗后｡

2.2.5 银杏内酯对MCAO大鼠脑组织及PBMC细胞中Keap1和Nrf2 mRNA表达的影响

与NC组比较,模型组､银杏内酯组大鼠脑组织及PBMC细胞中Keap1mRNA表达水平均明显上调(P<0.01),Nrf2 mRNA表达水平均明显下调(P<0.01);与模型组比较,银杏内酯组大鼠脑组织及PBMC细胞中Keap1 mRNA表达水平均明显下调(P<0.01),Nrf2 mRNA表达水平均明显上调(P<0.01)｡见表7｡

2.2.6 银杏内酯对MCAO大鼠脑组织及PBMC细胞中Keap1和Nrf2蛋白水平的影响

与NC组比较,模型组､银杏内酯组大鼠脑组织及PBMC细胞中Keap1指标蛋白水平均明显上调(P<0.01),Nrf2指标蛋白水平均明显下调(P<0.01);银杏内酯组较模型组,大鼠脑组织及PBMC细胞中Keap1指标蛋白水平均明显下调(P<0.01),Nrf2指标蛋白水平均明显上调(P<0.01)｡见表8,图4｡

图2 大鼠脑皮层组织苏木精-伊红染色(×400)

注:A为NC组,B为模型组,C为银杏内酯组;红色箭头所指细胞核皱缩､坏死,排列紊乱｡

3、讨论

CIS是由一系列有害的级联反应引起的脑组织损伤[13-14],其发病机制尚不明确｡血小板反应性以及凝血级联反应的异常激活可能参与CIS的发病｡研究发现,血小板反应性和聚集性与脑卒中发生密切相关,血管内膜损伤或出现血栓,凝血系统被激活,诱导血小板聚集,促进损伤病位黏附,释放活性物质,从而影响止血功能[15]｡脑缺血再灌注损伤的过程中,血管再通至活性氧增加,引起氧化应激反应,诱导蛋白质､RNA氧化损伤,继而损伤神经元细胞｡因此,有效减少脑卒中后氧化应激损伤可能成为一种新的治疗方式[16-17]｡研究发现,银杏内酯注射液可以通过调节氧化应激､能量代谢,改善I-R诱导的脑损伤[18]｡本文从临床和动物两个层面探讨了银杏内酯注射液对Keap1/Nrf2信号通路的调节作用,为CIS临床用药提供了详细的参考和依据｡

图3 各组大鼠脑梗死体积百分率

Keap1/Nrf2在抗氧化基因表达中发挥着重要的作用,是体内重要的抗氧化信号通路｡Nrf是氧化应激的中枢调节者,Nrf2通过提高抗氧化能力､抑制炎症因子等应对I-R,保护神经元细胞的正常功能[19]｡而且当氧化应激发生时,Nrf2在细胞内降低稳定性,与Keap1迅速发生解离,进行核转移,激活HO-1/NQO1等下游抗氧化基因的表达,从而减少活性氧诱导的组织损伤[20-21]｡因此,Keap1/Nrf2通路可能是维持细胞氧化还原稳态的防御系统｡Qi等[4]通过体内和体外实验共同证实了Keap1/Nrf2通路抑制剂通过调节与氧化应激相关的基因在脑I-R损伤中起保护作用｡Marghani等[22]在I-R小鼠脑组织中发现,与对照组和假手术组相比,Keap1 mRNA表达升高,Nrf2mRNA显著降低,炎症因子TNF-α､IL-6､IL-1βmRNA水平显著上升｡而通过激Keap1/Nrf2抗氧化信号通路,抑制了I-R诱导的氧化应激,改善了小鼠的神经功能｡Pan等[23]通过研究发现脑I-R损伤细胞模型中IL-6､IL-1β､TNF-α水平显著升高;研究者通过可降低Keap1表达,增强Nrf2表达,改善了细胞炎症和氧化应激反应｡因此,氧化应激增加和炎症细胞因子增多是脑I-R损伤的关键｡

表6 各组大鼠脑组织匀浆及血清中细胞因子表达水平比较(±s)

表7 各组大鼠脑组织及PBMC细胞中Keap1､Nrf2 mRNA表达水平比较(±s)

表8 各组大鼠脑组织及PBMC细胞中Keap1､Nrf2蛋白水平比较(±s)

图4 各组大鼠脑组织及PBMC细胞Keap1､Nrf2蛋白免疫印迹

银杏内酯注射液广泛应用于心脑血管病｡研究表明,银杏内酯可抑制血脑屏障渗透､维持神经元内环境稳态,抑制神经元凋亡;减轻脑水肿程度,改善因脑缺血引起的能量代谢紊乱;发挥抗氧化､抗炎作用,抑制细胞凋亡,增加星形胶质细胞数量,促神经发生[24]｡另有研究发现银杏内酯注射液可降低老年患者脑外周血管阻力,改善血液高凝状态,保护缺血后脑组织,营养脑神经的作用[25]｡药理学研究表明,银杏内酯A能促进脑部的血液循环､缓解痴呆症状,提高脑组织缺氧耐受性;银杏内酯B能抑制血小板活化因子与抗体的结合,是血小板活化因子拮抗剂,具有减轻损伤､抗氧化､抗炎的作用,并能改善神经元功能;银杏内酯C对心､脑血管疾病的治疗具有协同作用[26]｡在本研究中,观察组的有效率为93.33%,显著高于对照组,进一步证实了银杏内酯联合基础用药治疗CIS疗效显著｡

本研究的临床试验中,治疗后观察组较对照组NIHSS评分显著降低,而Barthel指数显著提高;外周血PBMC的Keap1蛋白表达水平明显下调,Nrf2mRNA及蛋白表达水平均明显上调｡动物实验中,与模型组比较,银杏内酯组大鼠神经功能评分显著下降,脑组织病理损伤程度降低,脑组织梗死体积缩小,脑组织匀浆及血清中炎性因子TNF-α､IL-2､IL-6水平显著下降,脑组织及PBMC中Keap1mRNA及蛋白表达水平明显下调,Nrf2mRNA及蛋白表达水平明显上调｡临床数据及动物实验结果显示,银杏内酯干预后,Keap1显著降低,Nrf2显著升高,炎性因子水平下降;这表明银杏内酯注射液可通过调节Keap1/Nrf2信号通路,抑制氧化应激反应,降低炎性因子水平,从而降低I-R的发生发展｡

综上所述,银杏内酯对CIS患者具有抗氧化应激､抗炎､保护神经功能等疗效｡本研究明确了Keap1-Nrf2是银杏内酯的作用靶点,但其具体分子机制尚需进一步探索｡

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基金资助:安徽省高校自然科学研究重点项目(编号:2023AH050828)~~;

文章来源:大珍,李良勇,夏本跃,等.银杏内酯治疗缺血性脑卒中的临床疗效及作用机制研究[J].安徽医学,2024,45(07):828-835.