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辽宁省1起手足口病暴发疫情的流行病学及病原学特征分析

2024-12-27 96 上传者：管理员

摘要：目的分析辽宁省1起手足口病（hand,foot,and mouth disease,HFMD）暴发疫情的流行病学及病原学特征，以期为该病防控策略的制定提供参考。方法 2022年，辽宁省大连市某幼儿园暴发1起HFMD疫情，共采集13名患者的粪便及咽拭子标本，进行核酸检测和病毒分离。阳性样本盲传3代后获得辽宁分离株，提取病毒核酸进行全基因组测序，测序结果于美国生物技术信息中心网站进行BLAST分析。从GenBank中下载柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CVA16）流行株及其主要血清型原型株序列作为参考株，同时以肠道病毒A71(enterovirus A71,EVA71)原型株为组外类群，应用MEGA 5.2软件进行同源性分析，采用邻接法构建基因进化树，对辽宁分离株与不同国家或地区不同年份流行株的CVA16 VP1进行系统进化分析。结果本次HFMD暴发疫情共报告19例患者，罹患率为7.45%，无重症及死亡病例报告；男性15例（占比78.95%），女性4例（占比21.05%）;4、5、6岁分别有4、9、6例；暴发时间为2022年6月14—21日，发病高峰在6月19日，出现10例，占病例总数的52.63%。共获得13株辽宁分离株，核苷酸序列同源性> 99.9%，与CVA16同源性最高，属于B1c亚群；VP1氨基酸序列相同，与原型株比较，于19处位点发生了突变。结论本次HFMD暴发疫情是由同一CVA16传染源引起的，今后应加强对CVA16的长期监测，为HFMD疫情早期预警提供科学依据，降低发病率。

关键词：
手足口病
柯萨奇病毒A组16型
流行病学
病原学
肠道病毒
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手足口病（hand，foot，and mouth disease，HFMD）是一种常见的全球性儿童急性传染病，由多种肠道病毒（enterovirus，EV）引起，主要包括A和B组柯萨奇病毒（Coxsackievirus，CV）及肠道病毒A71（enterovirus A71，EVA71）。随着2016年EVA71疫苗的问世，2017 —2019年，国内与EVA71相关的HFMD病例逐渐下降，但与CVA16相关的HFMD病例呈上升趋势［1⁃4］。长期监测结果发现，2014、2016、2019和2021年是辽宁省CVA16疫情的高峰期，表明CVA16每2～3年出现1次感染高峰期［5⁃7］，与国内其他研究结果相符［8⁃11］。目前，CVA16的基因分型方法主要有2种，1种是根据VP4编码序列将CVA16分为A、B和C 3种基因型，基因型B和C之间的核苷酸差异为5. 8%～11. 0%；另1种是根据VP1编码区将CVA16分为A和B 2种基因型，基因型B又分为B1和B2，二者间的核苷酸差异为11. 8%，B1可进一步分为B1a、B1b和B1c3个亚基因型［12］。我国大多采用后种方法对CVA16进行分型，国内主要以B1b基因亚型CVA16传播为主［13⁃20］。2018年，广东报告了首例中国B1c毒株感染病例［21］。CVA16是HFMD的主要病原体之一，面临疫苗缺乏、病毒进化和新基因型输入的潜在压力，未来仍存在CVA16疫情暴发的风险。本研究对辽宁省大连市某幼儿1起HFMD暴发疫情的流行病学和病原学特征进行分析，以期为HFMD疫情早期预警提供科学依据，降低其发病率。

1、材料与方法

1. 1病例报告

2022年6月14日，辽宁省大连市某幼儿园晨检时发现患儿口腔内出现疱疹，手部出现红疹，但未出现发热症状，遂带其前往妇婴医院门诊诊断为HFMD。随后，该患儿同班级及其他班级陆续出现病例，累计出现19例。

1. 2细胞

Vero细胞由辽宁省疾病预防控制中心保存并提供。

1. 3主要试剂

DMEM培养基及胎牛血清均购自美国Gibco公司；Pen⁃Strep solution 购自美国BiologicalIndustries公司；病毒核酸提取试剂盒（磁珠法）及CVA16核酸检测试剂盒均购自江苏硕士生物科技公司；ULSEN®超灵敏肠道病毒全基因组捕获试剂盒购自北京微未来科技有限公司；Nextera XT DNA Library Pre⁃paration Kit购自美国Illumina公司。

1. 4标本的采集及处理

疫情暴发期间共采集13份患者粪便和咽拭子标本，采集后立即冷藏并运输至实验室，核酸提取后进行核酸检测和病毒分离，标本处理和病毒分离培养具体操作按照《手足口实验室手册2010第4版》进行［22］。

1. 5病毒分离鉴定

将处理的13份标本分别接种至Vero细胞，于36℃，5% CO2条件下培养5～7 d。每天显微镜下观察细胞病变（cytopathic effect，CPE）情况，当出现75% CPE时，盲传3代，收获病毒培养上清，获得13株辽宁分离株，采用病毒核酸提取试剂盒（磁珠法）提取核酸，CVA16核酸检测试剂盒对病毒培养上清进行核酸检测；若连续2代均未发生CPE，则判为阴性。

1. 6同源性及进化树分析

采用ULSEN®超灵敏肠道病毒全基因组捕获试剂盒及Nextera XT DNA LibraryPreparation Kit制备辽宁分离株文库，并通过IlluminaMiniseq平台采用二代测序技术（Next Generation Sequen⁃cing，NGS）进行测序。测序结果在美国生物技术信息中心网站（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）进行BLAST比对分析，从GenBank中下载CVA16流行株及其主要血清型原型株序列作为参考株，同时以EV71原型株为组外类群，应用MEGA 5.2软件进行同源性分析，采用邻接法构建基因进化树，对辽宁分离株与不同国家或地区不同年份流行株的CVA16 VP1进行系统进化分析，自展值设为1 000。

1. 7数据采集及分析

应用Excel 2016软件进行数据采集、分析及作图。

2、结果

2. 1疫情暴发的流行病学特征

本次HFMD疫情暴发涉及大连一幼儿园6个班，共报告19例HFMD，罹患率为7. 45%，无重症及死亡病例报告。男性15例、女性4例，男女性别比为3. 75∶1，男生多于女生，分别中国生物制品学杂志2024年12月第37卷第12期Chin J Biologicals December 2024，Vol. 37 No. 12·1449·占总病例数的78. 95%和21. 05%；4岁4例，5岁9例，6岁6例。4个大班均有病例，其中大四班的罹患率最高（26. 3%），其次依次为一班（21. 0%）、三班（10. 5%）、二班（5. 3%）；从2022年6月14日出现首发病例开始至21日发现最后1例，病程是1个典型的HFMD暴发过程，发病高峰在6月19日，出现了10例病例，占病例总数的52. 63%。见图1。

图1 2022年6月HFMD发病的日期分布

2. 2病毒分离

13份粪便和咽拭子标本进行病毒培养，在Vero细胞上出现了典型的肿胀、变圆、聚集成葡萄串状的病变，见图2。经核酸鉴定为CVA16。

2. 3同源性分析

将本次疫情中分离获得的13株CVA16命名为LN⁃3⁃2⁃2022 ～LN⁃3⁃14⁃2022。测序拼接后得到CVA16基因组全长6 464～7 397 bp，BLAST分析显示，序列与CVA16同源性最高。13株CVA16在VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上差异均较小，同源性均> 99%，表明本次疫情是由同一毒株传播链引起的。13株CVA16辽宁分离株的全基因组核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97. 8%～99. 8%和96. 6%～99. 9%，其中LN⁃3⁃2⁃2022、LN⁃3⁃3⁃2022、LN⁃3⁃5⁃2022、LN⁃3⁃6⁃2022 和LN⁃3⁃9⁃2022 的核苷酸序列同源性最高，为99. 8%。13株辽宁分离株与国内流行株的全基因组核苷酸及氨基酸序列同源性分别为86%～88. 8%和65. 3%～70. 7%；与CVA16原型株的全基因组核苷酸及氨基酸序列同源性分别为77. 6%～79. 1%和46. 4%～48. 2%。13株辽宁分离株与CVA16原型株在各区段上的核苷酸同源性仅为37. 5%～90%。与国内分离株比较，在5'⁃UTR区段同源性最高，为90. 5%～96. 5%，而在VP4区段及3A、3B、3C区序列同源性差异较大，为74. 2%～90. 9%。见表1。

与原型株比较，本次疫情获得的13株辽宁分离株VP1氨基酸序列于19个位点发生了突变，其中位于GH环上的A213E、P215L、S217A、A220L处发现了可能与主要中和／抗原性表位相关的变异。见表2。

图2细胞发生CPE情况的镜下观察（×40）

表1 CVA16辽宁分离株基因组核苷酸与CVA16原型株及国内流行株各区段同源性分析

2. 4进化树分析

2018—2021年CVA16辽宁分离株全部为B1a和B1b基因亚型，与原型株的遗传距离较远，与国内地区分离株的遗传距离近。本次疫情获得的13株CVA16辽宁分离株与B1c亚型代表株位于同一分支，与引起2018年广州HFMD疫情的分离株MT119447／GZ／CHN／2018亲缘关系最近。见图3。推断本次疫情获得的辽宁分离株属于B1c亚群，这是我省首次分离出B1c亚群。

图3 CVA16分离株VP1区的系统进化树

表2 CVA16辽宁分离株的VP1氨基酸变异位点

3、讨论

2022年6月，大连一所幼儿园发生HFMD疫情。本研究分析了本次疫情的流行病学特征，并采集了13名HFMD患者的咽拭子和粪便标本，用于病原学和基因鉴定。本次疫情中共分离获得了13株CVA16，在VP1区核苷酸和氨基酸水平上差异均较小，VP1区核苷酸和氨基酸序列同源性均> 99%，表明本次疫情由同一传染源引发。进化树分析结果表明，13株CVA16可分为A、B两大基因型，CVA16原型株是A基因型的唯一成员，B基因型可分为B1a、B1b和B1c基因亚型。2018—2021年的CVA16辽宁分离株全部为B1a和B1b基因亚型，与原型株的遗传距离较远，与国内地区分离株的遗传距离近。本次获得的辽宁分离株自成一簇，与引起2018年广州HFMD疫情的分离株MT119447／GZ／CHN／2018亲缘关系最近，虽然两者在时间和空间上相距较远，核苷酸序列同源性却高达97. 4%～97. 7%，氨基酸序列同源性为93. 6%，提示辽宁省CVA16分离株在进化上并不是独立的，而是与国内地区CVA16同进化共循环的，不排除辽宁省2022年CVA16疫情株可能与广州流行株为同一进化来源或辗转来源于广州流行株。EV中和表位主要位于VP1区。与CVA16原型株的VP1氨基酸序列对比发现，本次疫情分离株于19处氨基酸位点发生了替换，这些替换位置在我国其他地区均有发现［13，16，18，23］。有研究表明，在VP1上有6个高度保守的中和线性抗原表位，本研究中这60. 1BlcBlaBlb中国生物制品学杂志2024年12月第37卷第12期Chin J Biologicals December 2024，Vol. 37 No. 12·1451·个保守位点均未发生突变，与前期研究结果一致［24］。有文献报道，VP1上有多个影响毒力和致病力的重要位点［19⁃20］，

本研究结果显示，辽宁分离株于主要中和抗原性表位（A213E、P215L、S217A、A220L）发生了相关变异，可能会导致CVA16流行毒株的抗原性改变。与其他B1菌株比较，B1c菌株在I235V和T240A上有2个同步突变［13］，本研究获得的辽宁分离株也发生了这2个位点的变异。在选择CVA16疫苗候选株时，应考虑不同地区和基因型的氨基酸变异。2008年以来，辽宁省一直对所有地区HFMD病例进行CVA16的病原筛查，近14年监测结果显示，2014、2016、2019和2021年是CVA16在辽宁省的流行高峰期，CVA16每2～3年为1个发病高峰，与国内其他研究结果一致［25］。辽宁省2018—2020年CVA16分离株为B1b基因亚群，2021年流行株为B1a型，与太原的监测结果相似［20，26］。本研究获得的辽宁分离株为本省首次分离到B1c亚群，与往年辽宁分离株遗传进化关系相对较远，表明辽宁省HFMD流行毒株发生较大变化，可能是一次输入性传播事件。有报道显示，1999—2000年我国所有分离株均属于B1a、B1b亚群；2005—2007年在马来西亚造成的传播流行毒株及2010年法国暴发HFMD疫情的分离株均为B1c亚群；我国于1999—2015年分离的CVA16属于B1a、B1b亚型；2013年，上海发现的1株CVA16为B1c亚群，与2005年马来西亚CVA16毒株核苷酸序列同源性为95. 1%，可能为输入性病例［27］。辽宁省CVA16分离株的基因型变化情况与国内流行趋势一致。综上所述，2022年辽宁省暴发HFMD疫情的分离株属于B1c亚群，这是本省首次发现B1c亚群，应加强对CVA16的长期监测，为早期预警提供科学依据，降低HFMD的发病率。

参考文献:

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基金资助:国家科技重大专项(2017ZX10103007-001,2017ZX10104001-005-003);

文章来源:雷露,王越,薄志坚,等.辽宁省1起手足口病暴发疫情的流行病学及病原学特征分析[J].中国生物制品学杂志,2024,37(12):1447-1452.