首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 公共卫生论文 > 流行病论文 > 某学校志贺氏菌疫情暴发微生物检验及结果分析

某学校志贺氏菌疫情暴发微生物检验及结果分析

2020-10-13 219 上传者：管理员

摘要：目的通过实验室检验,准确确定某校腹泻疫情的病原体,为迅速处理突发公共卫生事件提供科学依据。方法按照GB4789对样本进行增菌、分离、鉴定,并通过形态、生化实验、血清学实验、噬菌体实验进行鉴定。结果共采集肛拭子样本35份、水样(水源水、末梢水等)8份,共计43份,其中8份肛拭子样本检出鲍氏6型志贺氏菌,检出率为18.6%。结论本次痢疾疫情8株菌株用志贺氏菌分型噬菌体,原液型别均为27,1RTD均为33,原液及1RTD型别高度一致,各菌株之间亲缘性高度相关。

关键词：
交叉凝集
噬菌体分型
宋内氏菌
流行病
药敏试验
血清学实验
鲍氏菌
加入收藏

2018年9月20日酉阳县教委通报某学校出现多例症状为发热、腹痛腹泻、呕吐等症状的病例,县疾病预防控制中心调查人员立即赶赴现场进行采样及检验工作,后经流行病学调查,结合临床症状、实验室检验,确认这是一起由鲍氏6型志贺氏菌引起的腹泻疫情。笔者现将有关情况报告如下。

1、材料与方法

1.1样本来源及数量

来自该校疫情病例肛拭子样本35份,水样(水源水、末梢水等)8份,共计43份。

1.2检验项目

数种腹泻病原菌:沙门氏菌、志贺氏菌、致泻性大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157∶H7/NM。

1.3检验依据

GB4789[1,2,3,4,5,6,7]。

1.4仪器与试剂

成品培养基均来自青岛海博公司,均在效期内使用;沙门氏菌、李斯特菌、O157科玛嘉显色平板来自郑州博赛公司,批号20180312;肠杆菌科噬菌体来自广州金羿噬菌体公司,批号20180115;大肠埃希氏菌分型噬菌体来自广州金羿噬菌体公司,批号20180115;沙门氏菌诊断血清,志贺氏菌诊断血清,EPEC、EIEC、ETEC、O157诊断血清,霍乱弧菌O1群、O139群诊断血清来自宁波天润药业有限公司,批号20180108。VITEK2全自动细菌鉴定仪、革兰阴性菌鉴定卡(GN)来自生物梅里埃公司,失效期20181118。肠杆菌科微量生化管来自青岛海博公司,批号20180312。

2、结果

2.1增菌及分离培养

取样本C-B半固体1ml加入到10mlTTB,SC,志贺氏菌增菌肉汤,7.5%NaCl肉汤,APW,LB1,胰酪胨多粘菌素B肉汤,改良EC、EE,改良TSB中,经适宜条件培养后转种沙门氏菌显色平板,SS,DHL,XLD,BS,BP,Mac,SMAC,O157显色平板,EMB,血平板,弧菌显色平板,TCBS,4号琼脂,碱性琼脂,MYP,李斯特显色平板,PALCAM,适宜条件培养后发现1～8号样本在SS、DHL、EMB、XLD、Mac上有扁平,较大,粗糙菌落生长,其它平板未见可疑菌落生长。

2.2初步生化

样本编号1～7、9号,K/A,产气-硫化氢。

2.3详细生化

样本编号1～7、9号,KCN生长-U–赖AA-鸟AA-木糖-水杨素-七叶苷-枸橼酸盐-葡萄糖铵-5%乳糖-甘油+甘露醇+靛基质-棉子糖-ONPG。

2.4血清学实验

样本编号1～7,9号志贺氏四种多价+++,D群相+++,D群II相-,生理盐水-,血清学实验结果与生化不符,凝集C1-18型,C6-10++,分型血清不凝集,经复苏,C6凝集。

2.5肠杆菌科噬菌体准备及结果

试验菌液准备:自选择性琼脂上分别挑取两个以上典型或可疑菌落,稀释于盛有1～2ml营养肉汤管内,含菌量约为1×106CFU/ml。用无菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体,在琼脂平板表面三分之一的区域涂抹。3个涂抹区域之间保持适当距离,待菌液干燥,经过适宜条件培养,观察结果见表1。

表1肠杆菌科噬菌体结果

根据GB4789.31-2013,表3结果指向宋内氏II,福氏3。

2.6志贺氏菌分型噬菌体准备及结果

试验准备:营养琼脂平板若干,营养肉汤培养物:含菌量约1×106CFU/ml。1RTD噬菌体液:6种噬菌体按试剂说明书对应稀释。流布试验菌液:用无菌吸管吸出稀释菌液,快速滴注于琼脂平板不同部位,倾斜转动平板,使菌液流布平板,吸出多余菌液待琼脂表面干燥。滴加噬菌体液:将琼脂分两部分,依次滴加六种噬菌体原液及1RTD噬菌体,待噬菌体液完全被琼脂吸收后,于37℃培养5～6h,观察结果见表2、表3。

结果判定:以O-I、E-1、E-2、E-3、E-4、E-5为序,裂解按4,2,1计分,不裂解为0分。两组分别相加得两位数,O-I、E-1、E-2相加得十位数;E-3、E-4、E-5相加得个位数。

表31RTD

2.8药敏试验

依据NCCLS药敏试验标准纸片扩散法(K-B法)。培养基准备:水解酪蛋白琼脂若干。增菌液准备:挑取纯培养菌落接种于营养肉汤中,配置成0.5麦氏比浊标准菌悬液。接种MH平板:用无菌棉签蘸取培养液,挤压多余的液体后在琼脂表面均匀划线,布满平皿,确保接种菌均匀分布,最后用拭子绕琼脂平面边缘划两周,盖上皿盖,室温放置数分钟。贴药敏纸片:待平板水分完全吸收后,用消毒镊子将纸片放置于接种的琼脂表面并轻压,各纸片相距离不少于24mm,离平皿边缘不少于15mm。放入37℃培养24h。读取结果见表4。

表4药敏试验结果

2.9最终检验结果

8份粪便样本中检出鲍氏6型志贺氏菌,未检出其它致病菌。

3、讨论

3.1实验考虑方向通过流行病学调查,结合病例临床症状:主要为腹泻、发热、腹痛。腹泻(主要为粘液脓血便、黄色稀便):部分病例有里急后重,部分经临床检验血WBC>10×109/L,中性粒细胞百分率>70%,初步指向致病菌感染(因其具炎性反应)。临床上能引起痢疾症状的病原微生物很多[8],结合病例具脓血便、里急后重症状,重点倾向志贺氏菌,不排除沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蜡样芽胞杆菌、致泻性大肠埃希菌、霍乱弧菌、变形杆菌等。

3.2对于菌落形态方面发现部分病例肛拭XLD、Mac上均有扁平、较大、粗糙的菌落生长,明显倾向于宋内氏志贺氏菌(即D群),中国志贺氏菌感染以B+D群为主,迅速进行血清学试验,D群宋内氏Ⅰ相呈+++凝集,同时进行全自动细菌鉴定结果为志贺氏菌,证明病原体为志贺氏菌无误。

3.3关于宋内氏与鲍氏定群方面按照国标宋内氏与鲍氏13型鸟AA呈阳性,宋内氏ONPG为阳性。而本菌鸟AA为阴性,ONPG为阴性,初步排除宋内氏志贺氏菌;通过手工生化本菌甘露醇为阳性,可以排除A群;棉子糖呈阴性,排除B群;可以推断本菌为C群(鲍氏)志贺氏菌。在血清学与生化分型不一致时采用生化定群更为准确,VITEK2仅能确定几种生化实验,并不能开展全套生化实验,所以加强平时基层的手工生化实验及结果分析尤为重要,最后根据生化反应和血清学试验结果做出正确的判断[9]。

3.4关于鲍氏志贺氏菌定型的问题本菌生化型别指向鲍氏(C群),迅速与C群1～18型多价血清做凝集实验,发现C群6～10型多价血清呈凝集,而与分型血清均不凝集,无法定型。与市CDC相关专家交流后共同进行实验,采用本中心与市CDC同样的宁波天润血清(志贺氏菌属)也出现同样情况,实验暂告一段落。后经本中心检验科采用SS培养基对菌株重新分离培养,发现在C群6～10多价血清凝集后,C6(鲍氏6型)血清呈+++凝集,最终达到准确分型的目的。后经测定1～7、9号共8株与C6血清呈+++凝集,病例血清学分型一致,根据细菌性痢疾判定原则从同次疫情的多例病例的粪便中均检出血清学、生化型别一致的志贺氏菌,可以判定此次暴发事件由鲍氏6型志贺氏菌引起。志贺氏菌属是一群引起人类痢疾样腹泻的常见病原菌[10],通过饮食经口传染,并且人们对此普遍易感,只要少数细菌进入肠道就能引起感染[11],痢疾志贺氏菌引起敏感性和致死性流行,福氏和宋内氏志贺氏菌引起地方性流行[12],志贺氏菌由日本人志贺氏最先命名,发病症状主要为发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、脓血便、里急后重等,如不及时治疗,会出现中毒性菌痢,尤其是痢疾1型会产生志贺毒素,危害较大。目前发达国家菌痢主要为D群,每年全球患病人次高达1.65亿[13]。细菌性痢疾在我国是夏秋季常见的以腹泻为主的急性肠道传染病,居传染性疾病前5位[14],在卫生条件落后地区易流行[15],主要为B+D群,实验室检验结果报告时间非常重要。因此,迅速鉴定出病原菌的型别,对于疫情的控制、临床用药、疫情趋势的判断至关重要。

3.5笔者认为生化实验对于结果判断非常重要,普通实验室均采用全自动细菌鉴定仪,该仪器生化实验与传统生化不一致,如不仔细核对生化项目结果,极易误诊为宋内氏志贺氏菌,实验室应常备微量生化管,与全自动细菌鉴定仪生化结果核对,据报道仪器可有一定误诊率。仔细分析,由于近年来抗生素滥用,细菌发生变异,体现在表型特征,或是志贺氏菌型间基因的表型混合,使C群具有D群的特征,菌落较大、粗糙、与群血清交叉凝集。且噬菌体指向宋内氏,说明与宋内氏表面受体发生基因转换,菌痢菌型的变迁对病例构成、流行强度及毒力作用等均有重要影响[16]。建议加强此类菌的药敏监测,防止耐药菌株的出现。

3.6Sh具有高度属的特异性[17],是志贺氏菌的种属噬菌体,代表本菌具有侵袭力,具有侵袭力的志贺氏菌及EIEC都会裂解Sh,志贺在原液及1RTD均CL,EIEC原液CL,1RTD-,以此区分。可见Sh是类似于iPaH的,且等同于E-5。笔者发现用大肠埃希氏菌分型噬菌体原液型别为27,1RTD为33,可见原液的E-5及1RTD均裂解,借此说明为志贺氏无疑。笔者也发现8株菌原液及1RTD型别一致,具有高度流行病学关联,可以认为具有同一分子克隆,源于同一源暴发,结合药敏抑菌环大小一致相互印证。

3.7菌株同源性调查,国际推荐PFGE为最佳标准,准确率高、分辨率高、重现性、易于不同实验室比较,经PFGE证实,用其它方法检测不可能显示实质性的差异[18]。但笔者发现用大肠埃希氏菌分型噬菌体用于志贺氏菌溯源同样可以取得满意效果,孙吉昌[19]也做过相似实验,6h出结果、操作容易、费用低,适合基层实验室开展,建议推广,建立区域噬菌体型别数据库,共享资源,及时发现传染源,做好疾病防控。

3.8本中心所检出8株志贺氏菌在20种抗生素方面存在一致的耐药谱,且这8株菌在每种抗生素作用下均呈现等大的抑菌环,说明这8株菌在耐药基因位点具有高度的一致性,根据志贺氏菌不同抗性进行分类或者也是一种溯源方法,可为疫情处置提供科学支持。笔者发现这8株菌对卡拉霉素、头孢曲松、复方新诺明、新霉素、痢特灵、诺氟沙星、氧氟沙星、四环素、头孢他啶、庆大霉素、环丙沙星呈现敏感,对头孢呋辛、青霉素、苯唑西林、红霉素、氨苄西林呈现耐药,志贺氏菌多重耐药现象非常普遍[20,21]。所以,应加强耐药监测,防止耐药株的出现[22],从而为临床提供科学用药支持,对于缩短病程、减少排菌时间、病人康复有重要作用。

参考文献：

[1]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.GB4789.4-2016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验[S].北京:中国标准出版社,2018.

[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.GB4789.5-2012食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验[S].北京:中国标准出版社,2018.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.GB4789.6-2016食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验[S].北京:中国标准出版社,2018.

[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.GB4789.7-2013食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验[S].北京:中国标准出版社,2018.

[5]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.GB4789.10-2016食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验[S].北京:中国标准出版社,2018.

[6]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.GB4789.30-2016食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验[S].北京:中国标准出版社,2018.

[7]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.GB4789.36-2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157∶H7/NM检验[S].北京:中国标准出版社,2018.

[8]李志明.志贺氏菌传统检验方法研究进展[J].食品安全质量检测学报,2019,3(10):571-575.

[9]陈建辉,谢一俊,吴珍红,等.8株与诊断血清交叉凝集的肠杆菌分离与鉴定[J].预防医学文献信息,2004,10(2):180-181.

[10]汪燕,蒋秀芬,汪珩.两批志贺氏菌感染的特点分析[J].云南医药,2002,23(5):366-367.

[11]龙春平,吴周建.2株志贺氏菌的鉴定分析[J].实用预防医学,2005,10(12):1197-1198.