前列腺癌是男性最常见的肿瘤,每年约30万人因其而死亡,是继肺癌后男性第二大死亡原因[1],我国发病率呈逐年增长的趋势[2]｡ 前列腺癌极易引起膀胱出口梗阻､ 下尿路症状和远处转移,不仅对患者生活质量造成严重影响,由此衍生出的抑郁､ 焦虑等情绪异常使患者的幸福感大大降低[3⁃4]｡ 前列腺癌确诊时往往已经处于发病的中晚期,多采用内分泌治疗和化疗,常伴随不良反应,易产生耐药性和免疫耐受,导致进展成去势抵抗型前列腺癌,并出现全身多处转移[5]｡ 目前,前列腺癌的发病机理并没有完全明确,主要与细胞增殖､ 凋亡､ 细胞周期等调控失常有关,而这些恶性生物学进程与细胞内信号转导通路异常激活关系紧密[6], Wnt信号通路在前列腺癌发病中扮演了重要角色,可作为潜在靶点[7]｡ 中医将前列腺癌本质概括为 “肾虚血瘀”,并确定了补肾益气､ 化瘀散结治法,创制了益肾通癃汤,前期研究已证实其治疗前列腺癌真实有效,能明显缓解患者排尿困难､ 食欲减低､ 乏力等症状,提高生活质量,对化疗药物有减毒增效的作用,但其作用机制需要进一步证实[8]｡ 本研究以人前列腺癌脑转移细胞DU 145为研究对象,探讨益肾通癃汤对DU 145细胞经典Wnt / β⁃catenin信号通路的影响｡

1、材料

1. 1动物SPF级雄性SD大鼠,体质量200~ 250 g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[实验动物生产许可证号SCXK (湘) 2019⁃0004],饲养于湖南中医药大学第一附属医院医学创新实验中心SPF级动物房[实验动物使用许可证号SYXK (湘) 2020⁃0010]｡ 研究经湖南中医药大学第一 附 属 医 院 实 验 动 物 伦 理 委 员 会 批 准(伦 理 号ZYFY20211008⁃41)｡

1. 2细胞系 人前列腺癌脑转移细胞DU 145,由中南大学湘雅二医院王荫槐教授团队馈赠｡

1. 3药物 益肾通癃汤由盐补骨脂15 g､ 黄芪30 g､ 熟地黄15 g､ 醋三棱10 g､ 醋莪术10 g组成,所有药材均由湖南中医药大学第一附属医院门诊中药房提供,经湖南中医药大学第一附属医院张志国教授鉴定为正品,饮片加蒸馏水浸泡､ 煮沸､ 煎熬､ 浓缩后,制成生药量0. 72 g / mL的药液｡Wnt信号通路阻断剂Indocyanine green⁃001 ( ICG⁃001)购自凯立德生物医药技术(上海)有限公司( 50mg /支,批号847591⁃62⁃2)｡

1. 4试剂PBS ( pH 7. 2 ~ 7. 6) (美国HyClone公司,批号SH30256. 01);基质胶(美国BD公司,批号354262);结晶 紫(北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司,批 号G1062 );Transwell小室[康宁连续制药科技(苏州)有限公司,批号3428];还原型5XSDS上样缓冲液､TEMED､ 电泳液缓冲液､10×丽春红染液､RIPA裂解液､SuperECL Plus超敏发光液(美国Abiowell公司,批号AWB0055､AWB0068､AWB0083､AWB0225､AWB0136､AWB0005);蛋白酶 抑制剂(北京金泰宏达生物科技有限公司,批号583794);显影液(上海市佳信科技有限公司,批号BW⁃61); mRNA逆转录试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司,批号CW2569); CCK8试剂盒(北京拜尔迪生物技术有限公司,批 号20220516A ); Wnt1､β⁃catenin､β⁃actin､HRP goatanti⁃mouse IgG､HRP goat anti⁃rabbit IgG抗 体(美 国Proteintech公司,批号27935⁃1⁃AP､51067⁃2⁃AP､66009⁃1⁃Ig､SA00001⁃1､SA00001⁃2); Wnt3a､GSK⁃3β､p⁃GSK⁃3β､APC抗体(英国Abcam公司,批号ab219412､ab93926､ab131097､ab40778)｡

1. 5仪器CO2培养箱(日本SANYO公司,型号MCO⁃15AC);酶标仪(南京贝登医疗股份有限公司,型号B⁃2744);超净工作台(北京亚泰科隆仪器技术有限公司,型号YT⁃CJ⁃2NB);倒置生物显微镜(北京中显恒业仪器仪表有限公司,型号DSZ2000X);摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司,型号TS⁃1);台式冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司,型号H1650R);电泳仪､ 电泳槽(北京六一生物科技有限公司,型号DYY⁃6C､DYCZ⁃24DN);磁力搅拌器(上海仪电科学仪器股份有限公司,型号JB⁃13);生物样品均质仪(杭州奥盛仪器有限公司,型号BioPrep⁃24);化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司,型号ChemiScope6100);荧光定量RCP仪(美国Thermo公司,型号PIKOREAL96)｡

2、方法

2. 1含药血清制备

30只大鼠适应性喂养3 d,随机分为空白血清组(6只)和含药血清组(24只),含药血清组大鼠灌胃给予益肾通癃汤药液2 mL,空白血清组大鼠灌胃给予蒸馏水2 mL,每天1次,连续7 d｡ 临床成人益肾通癃汤给药剂量为1. 14 g / kg,根据体表面积比值换算,大鼠等效给药剂量为7. 20 g / kg｡ 各组大鼠于最后一次灌胃前禁食不禁水12 h,灌胃结束2 h后采血, 2%戊巴比妥钠麻醉,碘伏消毒,腹中线切口,逐层切开皮肤直至腹腔,暴露腹主动脉并行穿刺采血,血液经静置､ 离心后取上层血清,过滤除菌､ 灭活后置于-80℃冰箱中保存｡

2. 2细胞复苏和传代

将DU 145细胞转移至含完全培养基(含40 mL DEME高糖细胞培养基､10 mL胎牛血清､0. 5 mL双抗)的细胞培养瓶中, 37℃ ､5% CO2培养箱中培养,待细胞生长至80% ~ 90%时用适量PBS洗涤,添加胰酶,置于恒温培养箱中持续消化2 min,将消化好的细胞置于显微镜下,观察到其基本脱壁､ 外观呈圆形时终止消化,轻柔反复吹打以使其完全脱壁,将细胞全部吸出,转移至15 mL离心管中, 1 000 r/ min离心5 min,吸出上清液,添加5 mL完全培养基,反复轻柔吹打均匀,将其均分为6份,分别加到细胞培养瓶中,置于37℃ ､5% CO2培养箱中继续培养｡

2. 3细胞培养､ 分组及给药

DU 145细胞进行培养､ 消化､ 传代,在96孔板中添加100 μL悬液｡ 将细胞分为空白血清组,阳性药物组,益肾通癃汤低､ 中､ 高剂量组,联合用药组,其中空白血清组加入空白血清,阳性药物组加入含25 μmol / L ICG⁃001的0. 25% DMSO,益肾通癃汤低､ 中､ 高剂量组分别加入5%､10%､15%益肾通癃汤含药血清,联合用药组加入25 μmol / L ICG⁃001和15%益肾通癃汤含药血清｡

2. 4 CCK⁃8比色法检测细胞增殖情况

给药处理24 h后弃去培养基,加入200 μL 50 μg / mL基质细胞衍生因子⁃1(SDF⁃1),设为对照组,将培养板放入培养箱中孵育24 h,每孔加入10 μL CCK⁃8试剂,培养箱内孵育约100 min,于450 nm波长处检测光密度(OD),计算抑制率,公式为抑制率= (1-OD给药组/ OD空白血清组) ×100%｡

2. 5 Transwell小室法检测细胞侵袭和迁移能力

每孔加入100 μL无血清MEM培养基稀释的Matrigel ( 200 μg),检测细胞迁移能力则无需上述步骤｡ 小室下层加入含500 μL10%胎牛血清完全培养基,胰酶消化成单个细胞,无血清培养基重悬至密度为2 × 106/ mL,每孔加入100 μL,在37℃培养箱中培养48 h,取出上室, PBS洗3次,用棉球擦干净上室细胞, 4%多聚甲醛固定20 min, 0. 1%结晶紫染色5 min,水洗5次,于倒置显微镜下观察上室外表面细胞,各取3个视野进行拍照,取出小室,加入500 μL10%醋酸浸泡脱色,于550 nm波长处检测OD,计算抑制率｡

2. 6 RT⁃qPCR法检测细胞

Wnt1､Wnt3a､β⁃catenin､GSK⁃3β､APC mRNA表达TRIzol试剂提取细胞总RNA,检测总RNA浓度,按照试剂盒进行逆转录反应, SYBR法进行扩增反应,引物序列见表1,反应条件为95℃ 预变性10min, 95℃变性15 s, 60℃ 退火30 s,共40个循环,以β⁃actin为内参,采用2-ΔΔCT法进行相对定量处理｡

表1引物序列基因

2. 7 Western blot法 检 测 细 胞

Wnt1､Wnt3a､β⁃catenin､GSK⁃3β､p⁃GSK⁃3β､APC蛋白表达 用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞,提取蛋白, BCA法检测蛋白浓度,取等量蛋白进行变性,加入上样缓冲液后冷冻保存,制备聚丙烯酰胺凝胶,上样,电泳,湿转法转移至PVDF膜, 5% BSA室温封闭1 h,分别加入Wnt1 ( 1∶1500)､Wnt3a (1∶1 000)､β⁃catenin (1∶5 000)､GSK⁃3β(1∶500)､p⁃GSK⁃3β ( 1∶500)､APC ( 1∶500)抗体,4℃孵育过夜,次日加入二抗(1∶6 000)室温孵育1 h,ECL显影,以β⁃actin为内参,通过ImageJ软件计算蛋白相对表达量｡

2. 8统计学分析

通过SPSS 23. 0软件进行处理,计量资料以(x±s)表示,满足独立性､ 正态性及方差齐性时多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD检验和Dunnett检验;不满足正态性､ 方差齐性时多组间比较采用秩和检验,组间两两比较采用Kruskal⁃Wallis H检验｡P<0. 05表示差异具有统计学意义｡

3、结果

3. 1益肾通癃汤对DU 145细胞增殖情况的影响

与空白血清组比较,各含药血清组细胞增殖抑制率升高( P <0. 01);与阳性药物组比较,益肾通癃汤低､ 中剂量组细胞增殖抑制率降低(P<0. 01),高剂量组和联合用药组细胞增殖抑制率升高(P< 0. 01),以联合用药组更明显( P<0. 01),见表2｡

表2益肾通癃汤对DU 145细胞增殖情况的影响

3. 2益肾通癃汤对DU 145细胞侵袭情况的影响

与空白血清组比较,各含药血清组细胞侵袭抑制率升高( P <0. 01);与阳性药物组比较,益肾通癃汤各剂量组细胞侵袭抑制率降低(P<0. 01),并呈剂量依赖性,联合用药组细胞侵袭抑制率升高(P<0. 01),见表3､ 图1｡

表3益肾通癃汤对DU 145细胞侵袭情况的影响

3. 3益肾通癃汤对DU 145细胞迁移情况的影响

与空白血清组比较,各含药血清组细胞迁移抑制率升高( P <0. 01);与阳性药物组比较,益肾通癃汤各剂量组细胞迁移抑制率降低(P<0. 01),并呈剂量依赖性,联合用药组细胞迁移抑制率升高(P<0. 01),见表4､ 图2｡

图1各组DU 145细胞侵袭情况

图2各组DU 145细胞迁移情况(×100)

3. 4益肾通癃汤对DU 145细胞Wnt1､Wnt3a､β⁃catenin､GSK⁃3β､APC mRNA表达的影响

与空白血清组比较,各含药血清组细胞Wnt1､Wnt3a､β⁃catenin､APC mRNA表达降低(P<0. 01), GSK⁃3β mRNA表达升高(P<0. 01);与阳性药物组比较,益肾通癃汤低､ 中剂量组细胞Wnt1､Wnt3a､β⁃catenin､APC mRNA表 达 升 高( P < 0. 05, P <0. 01), GSK⁃3β mRNA表达降低(P< 0. 01),联合用药组细胞Wnt3a､β⁃catenin､APC mRNA表达降低( P < 0. 05,P<0. 01), GSK⁃3β mRNA表达升高(P<0. 01),见表5｡

3. 5益肾通癃汤对DU 145细胞Wnt1､Wnt3a､β⁃catenin､GSK⁃3β､p⁃GSK⁃3β､APC蛋白表达的影响

与空白血清组比较,各含药血清组细胞Wnt1､Wnt3a､β⁃catenin､APC､p⁃GSK⁃3β蛋白表达降低(P<0. 05, P<0. 01),益肾通癃汤中､ 高剂量组和联合用药组细胞GSK⁃3β蛋白表达升高(P<0. 05, P<0. 01);与阳性药物组比较,益肾通癃汤低､中剂量组细胞Wnt1､Wnt3a､β⁃catenin､p⁃GSK⁃3β､APC蛋白表达升高(P<0. 05, P<0. 01),高剂量组细胞Wnt3a､β⁃catenin蛋白表达升高(P<0. 01),联合用药组细胞Wnt3a､β⁃catenin､p⁃GSK⁃3β､APC蛋白降低(P< 0. 05, P< 0. 01),GSK⁃3β蛋白表达升高(P<0. 01),见表6､ 图3｡

表5益肾通癃汤对DU 145细胞Wnt1､Wnt3a､β⁃catenin､GSK⁃3β､APC mRNA表达的影响

表6益肾通癃汤对DU 145细胞Wnt1､Wnt3a､β⁃catenin､GSK⁃3β､p⁃GSK⁃3β､APC蛋白表达的影响

图3各组DU 145细胞Wnt1､Wnt3a､β⁃catenin､GSK⁃3β､p⁃GSK⁃3β､APC蛋白表达

4、讨论

目前,前列腺癌发病机制并没有完全明确,普遍认可的主要与前列腺细胞增殖/凋亡异常､ 炎症应激､ 肿瘤细胞免疫耐受､ 氧化/抗氧化失衡､ 蛋白酶/抗蛋白酶失衡､ 组织重构等相关[9⁃11]｡ 肿瘤的发生､ 侵袭､ 远处转移等恶性生物学进程多与细胞内信号传导通路异常激活密切相关[12]｡ 细胞增殖､ 细胞周期､ 细胞凋亡等异常是肿瘤发生的标志性特征之一,因而抑制肿瘤细胞增殖､ 诱导其凋亡､阻抑其侵袭和迁移等是目前大部分药物抗肿瘤的重要机制[13⁃14]｡ 经典Wnt / β⁃catenin信号通路是一条高度保守的信号通路,诱导和调节多种肿瘤细胞的发生｡ 其常见的配体为Wnt1和Wnt3a, Wnt1在前列腺癌细胞增殖､ 细胞迁移､干细胞更新等方面的作用至关重要, Wnt3a则可促进骨转移在前列腺癌中的发生｡ 生理情况下, Wnt信号通路是关闭的状态,细胞质中的β⁃catenin与糖原合成酶激酶(GSK⁃3β)､ 酪蛋白激酶(CK1)､ 轴蛋白(AXIN)和腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)结合,最终被GSK⁃3β降解｡ 当细胞外的Wnt信号分子与细胞膜上的特异性受体卷曲蛋白(Fzd)和低密度脂蛋白相关受体蛋白5 / 6 (LRP⁃5/ 6) 2种受体相结合,会将信号传递给胞内,造成GSK⁃3β磷酸化而失去活性,阻止了GSK⁃3β对β⁃catenin的降解,使得β⁃catenin在细胞质中聚集[13]｡ 当β⁃catenin达到一定浓度水平后,则转移至细胞核,与核内转录因子T细胞因子/淋巴样增强因子(TCF/ LEF)结合,形成复合体,激活原癌基因如cyclinD1､C⁃myc等,导致肿瘤细胞的增殖､ 分化和成熟[15⁃16]｡已有研究显示, Wnt抑制剂有望成为前列腺癌治疗的有效药物[17]｡中医没有前列腺癌直接对应的病名,将本病归为“癥积病” 的范畴,其发病应紧紧抓住2个字,一个是“虚”,所谓“虚损生积”;一个是“瘀”,所谓“血瘀致癥”, “肾虚血瘀” 是对前列腺癌癥积本质和病机的高度概括[18⁃19],故在治疗上当以补肾益气､ 化瘀散结,并由此确定了补肾活血法治疗前列腺癌的基本方药———益肾通癃汤,其由熟地黄､ 黄芪､ 补骨脂､ 三棱､ 莪术组成｡ 前期研究显示,益肾通癃汤能够降低前列腺癌细胞中Bcl⁃2､cyclin E1表达,升高Bax､cyclin D1表达,而这些多为Wnt信号通路的下游靶点,而且其中的5味中药大多具有抗炎､ 抗氧化､抗肿瘤､ 调节免疫､ 调控细胞增殖与凋亡､ 抑制EMT等活性,故课题组设计了细胞实验来观察益肾通癃汤对DU 145细胞Wnt / β⁃catenin信号通路的影响[20⁃21]｡ 结果显示,益肾通癃汤可以有效抑制人前列腺癌脑转移细胞DU 145的增殖､ 侵袭､ 迁移,且药效与剂量呈正相关性;降低Wnt / β⁃catenin信号通路相关基因Wnt1､Wnt3a､β⁃catenin､APC253mRNA及蛋白表达,升高Wnt / β⁃catenin信号通路相关基因GSK⁃3β mRNA及蛋白表达,降低p⁃GSK⁃3β蛋白表达,从而发挥调控Wnt信号通路的作用,并呈依赖性;与Wnt信号通路阻断剂ICG联用时效果最佳,有协同增效的作用｡综上所述,益肾通癃汤很可能是通过调控Wnt信号通路来实现治疗前列腺癌的作用,在前列腺癌保守治疗方面具有一定的临床价值和应用前景｡

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基金资助:国家自然科学基金青年科学基金(82205112);湖南省自然科学基金面上项目(2021JJ30396);湖南省自然科学基金青年基金(2022JJ40335);湖南省卫生健康委科研计划课题(B202304058417,202103051239);湖南省中医药科研计划重点指导课题(E2022009);湖南省中医药科研计划课题(B2023096,2021108);

文章来源:朱文雄,袁轶峰,刘慧,等.基于Wnt/β-catenin信号通路探讨益肾通癃汤对人前列腺癌细胞DU 145的影响[J].中成药,2025,47(01):250-254.