膀胱癌（BC）是世界上最常见的癌症之一，生存率低且远处转移频繁[1]。BC诊断需要侵入式的膀胱镜检查和活组织检查，通常伴有不良反应[2]。尿液细胞学作为无创性的标记技术也在广泛使用，但是容易漏检低等级的膀胱癌。因此迫切需要开发用于BC初始检测和监测的新型诊断方法[3]。液体活检是一种方便、快速、无创的检测方式，体液样本中DNA和RNA可作为诊断、预后和监测恶性肿瘤的潜在标志物[4]。根据肿瘤的组织类型和排出体液的方式，非血液液体活检在肿瘤诊断具有新的潜力。针对BC而言，尿液样本相比于血液样本更容易获得，并含有大量有意义的特殊分子标记物，如RNA和代谢产物等，且本身的物质复杂水平远远低于血液样本，这大大降低了RNA处理和分析过程的干扰[5]。基于尿液样本核酸肿瘤标记物的检测，已经在BC诊断中有所报道，例如尿液中的细胞和无细胞DNA可通过尿液甲基化分析用于BC诊断[6]。尿液NMP22、CK20和存活素mRNA可作为标志物用于BC的诊断[7]。但是尿液中存在DNA酶和RNA酶，会降低mRNA的稳定性和含量，因此mRNA作为标记物的使用还会面临很多问题。与长链的mRNA相比，非编码miRNA仅有19～22nt的长度，不易降解，具有很好的稳定性。尿液miRNA作为肿瘤标记物具有较高诊断价值，本研究旨在制备BC尿液miRNA检测模型，并进行临床诊断价值评价。

1、对象与方法

1.1病例选择及一般资料

选取2017-12-01-2018-05-31就诊于宁夏医科大学总医院泌尿外科膀胱癌患者作为研究对象。纳入标准：均具有典型临床表现的住院患者；经由膀胱镜检及病理确诊，均进行手术切除，病理分期符合2002年WHO的TNM临床分期标准；尿路感染患者纳入标准为具有典型临床表现，尿沉渣白细胞>30或显微镜镜检白细胞>8。排除标准：住院时间<24h的患者；放弃治疗的患者；存在自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病以及肿瘤患者；近期接受免疫抑制治疗者；一周内得过感染性疾病或者服用过抗生素的患者（尿路感染患者除外）；具有慢性疾病的患者或长期服药的患者。

根据纳入和排除标准共选取48例膀胱癌患者和23例尿路感染患者，另选取同期在宁夏医科大学总医院健康体检者22名作为对照。本实验经宁夏医科大学伦理委员会审批（伦理编号：2019-157），所有标本来源的患者和健康对照者均签署了知情同意书。

1.2实验分组

特异性miRNA的筛选收集48例标本，共分为4组，对照组：健康体检患者12名，男5名，女7名，中位年龄58岁；感染组：尿路感染患者12例，男2例，女10例，中位年龄64岁；T1期肿瘤组：膀胱癌T1期患者12例，男7例，女5例，中位年龄69岁；T2+T3期肿瘤组：膀胱癌T2a期2例，T2b期5例，T3a期4例，T3b期1例，男8例，女4例，中位年龄73岁。

再次收集45例样本纳入后期验证实验，共分为4组，其中对照组：10名健康体检者，男6名，女4名，中位年龄61岁；感染组：11例尿路感染患者，男3例，女8例，中位年龄64岁；T1期肿瘤组：11例膀胱癌T1期患者，男7例，女4例，中位年龄68岁；T2+T3期肿瘤组：13例膀胱癌T2+T3期患者，T2a期5例，T2b期3例，T3a期4例，T3b期1例；男7例，女6例，中位年龄70岁。

1.3主要试剂及仪器

HEPES溶液（1mol/L,pH7.5）购自Thermo Fisher Scientific公司；异硫氰酸胍购自Sigma公司；miRcute miRNA提取分离试剂盒（DP501）、miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒（kr211）、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒（FP411）、miRNA检测引物均购自于北京天根生物有限公司；荧光定量PCR仪（Roche,LightCycler480Ⅱ）；低温高速冷冻离心机（Eppendorf,5810R）；生物安全柜（ESCO,AC2-2S1);-80℃低温冰箱（Panaso-nic,MDF-U54V）。

1.4样本收集

样本的收集采用15mL无菌无酶离心管，收集新鲜晨尿中段尿7mL，其中加入3.54g异硫氰酸胍，待溶解完全后加入HEPES盐溶液调节尿液样本的pH值至7，最终定容至总体积10mL，此时HEPES浓度为0.5mol/L，异硫氰酸胍浓度为3mol/L，样本统一-80℃保存。

1.5miRNA的提取

miRNA的提取采用miRcute miRNA提取分离试剂盒进行。将收集的尿液样本解冻，全部转移至50mL无菌无酶离心管，加入5mL氯仿，剧烈震荡，室温静止后溶液形成分层。将上层水相全部转移至试剂盒中二氧化硅过滤柱，4℃12000r/min离心1min,r=5.5cm，按照试剂盒说明书进行洗涤，最终溶解于20μL无菌无酶水中。

1.6miRNA的定量PCR检测

采用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒，采用3’加polyA尾巴的方法进行miRNA第一链cDNA的反转录。加入8μLRNA提取液，2×miRNARTReactionBuffer10μL,miRNARTEnzymeMix2μL，总体积为20μL。反应条件为42℃60min,95℃3min。合成的cDNA反应液放置于-20℃保存。采用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒（SYBR Green）进行miRNAs的表达检测。2×miRcutePlusmiRNAPreMix10μL,Reverse Primer（试剂盒自带通用引物，10μmol/L)0.4μL,Forward Primer（购买的检测引物及U6检测引物，10μmol/L)0.4μL,miRNA第一链cDNA2μL,ddH2O补足至20μL。荧光定量PCR上机反应条件为95℃15min;94℃20s,63℃30s,72℃34s,5个循环；94℃20s,60℃34s,40个循环，每个孔设5次重复，取平均值进行计算，每对引物设置阴性质控，采用ddH2O作为阴性模板对照。U6上游检测引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游为通用引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用LightCycler4801.5版软件进行Ct值分析。

1.7特异性miRNA的筛选

根据Amuran等[8]对膀胱癌患者尿液中各种miR-NA的生物标志物特性的报道，筛选了hsa-miR-125b、hsa-miR-126、hsa-miR-152、hsa-miR-182、hsa-miR-199a、hsa-miR-204、hsa-miR-143、hsa-miR-133a、hsa-miR-146a和hsa-miR-124，合计10个miRNA对尿液miRNA含量进行分析。

1.8实验分组和计算方式

每个分组中，以U6Ct值最小的，即U6含量丰度最高的样本定义为100%表达，其余样本U6的相对表达含量为2-(Ct组内其他样本）/2-(CtU6丰度最高样本100%）。根据U6的含量进行标准化每个样本，即取等量U6的cDNA，上样量仍为2μL，在组间进行相对定量的表达分析，miRNAs的相对含量=2-ΔΔCt=2-[实验组（Ct目标miRNA-CtU6）-对照组（Ct目标miRNA-CtU6）]。

1.9统计学方法

数据统计及图形绘制采用Grapdpadprism7.0软件，首先进行正态分布检验，如符合采用one-wayANOVA方法分析组间差异，两两比较采用Dunnett-t检验，miRNA检测Ct的比值（CtTargetA/CtTargetB）作为诊断指标，进行ROC曲线分析，采用双侧检验，检验水准α=0.05。

2、结果

2.1不同分组miRNAs的表达差异分析

表1示，miR-126、miR-182和miR-146a在48个标本中均能检测到相应的Ct值，且Ct值均小于阴性质控Ct值，阴性质控CtmiR-126为36.21±0.57,CtmiR-182为37.44±0.68,CtmiR-146为37.26±1.06，且方差分析显示组间差异有统计学意义，可以作为候选miRNA标志物进行验证。

表1miR-126和miR-182及miR-146a在各个组中的平均Ct值及统计分析

2.2尿液miRNA内参的选择

所有样本U6的Ct值均可检测，但是组间差异较大，对照组为31.57±0.63，感染组为33.64±0.77,T1期肿瘤组为30.67±1.01,T2+T3期肿瘤组为29.53±0.86，并且其中12.5%(6/48）的标本Ct值位于阴性质控（38.16±0.94）附近，因此不适用于做内参。而经过U6等量化样本的cDNA上机后发现miR-152在4个组中的Ct值较为稳定，对照组为30.42±0.85，感染组为30.64±0.93,T1期肿瘤组为30.26±0.47,T2+T3期肿瘤组为29.91±0.62，无Ct值接近阴性质控（38.23±0.91）的现象，在本实验中作为内参成分。

2.3miRNA比值作为标记物的分析

再次选取45例样本进行Ct比值分析，结果如图1所示，CtmiR-126/CtmiR-152组间差异有统计学意义（F=3.396,P<0.05），相比于对照组（0.98±0.15），感染组（0.89±0.18）、T1期肿瘤组（0.89±0.25）、T2+T3期肿瘤组（0.91±0.24）比值均降低，t值分别为3.608、3.017和2.286，均P<0.05;CtmiR-182/CtmiR-152组间差异有统计学意义（F=8.139,P<0.01），相比于对照组（1.09±0.25）、感染组（0.99±0.12）、T1期肿瘤组（0.96±0.22）、T2+T3期肿瘤组（0.94±0.24）比值均降低，t值分别为3.672、3.705和4.090，均P<0.05;CtmiR-146a/CtmiR-152组间差异有统计学意义（F=4.617,P<0.01），相比于对照组（0.98±0.21）、感染组（0.90±0.22）、T1期肿瘤组（0.84±0.28）、T2+T3期肿瘤组（0.82±0.14）比值均降低，t值分别为2.685、3.934和2.925，均P<0.05。

2.4miRNA比值的诊断价值分析

图2示，将T1期肿瘤组和T2+T3期肿瘤组进行合并，以对照组进行ROC曲线分析，CtmiR-126/CtmiR-152的AUC值为0.7917，特异性70.00%，灵敏性83.33%;CtmiR-182/CtmiR-152的AUC值最高为0.8875，特异性80.00%，灵敏性83.33%;CtmiR-146a/CtmiR-152的AUC值为0.8625，特异性90.00%，灵敏性79.17%。如果将对照组和感染组合并，进行ROC曲线分析，CtmiR-126/CtmiR-152的AUC值为0.6151，特异性61.90%，灵敏性62.50%;CtmiR-182/CtmiR-152AUC值仍然最高为0.7837，特异性71.43%，灵敏性70.83%;CtmiR-146a/CtmiR-152的AUC值为0.7421，特异性66.67%，灵敏性66.67%。

图1各组miRNACt比值

图2miRNACt比值的ROC曲线

3、讨论

尿液中的核酸分子作为无创BC标记物的有效性已经得到了证实，早在2007年就有学者以尿液中人类端粒酶逆转录酶（hTERT)mRNA作为标记物，进行BC早期的无创诊断研究[9]。Xie等[10]后续建立了以荧光定量PCR进行检测BC脱落细胞的hTERTmRNA表达模式，证实了hTERTmRNA可作为BC早期诊断和预后判断的指标。March-Villalba等[11]针对63例有膀胱肿瘤史及疑似患者和28例BC患者尿液标本的hTERTmRNA表达进行了检测，判断其诊断价值，结果发现hTERTmRNA作为尿液标本的肿瘤标志物，灵敏度为76%，远远高于尿道脱落细胞学和NMP22。然而，Weikert等[12]应用实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术对163例BC患者和237例正常人hTERTmRNA的表达水平进行分析，尿液标本的灵敏度只有55.2%，仍然大于脱落细胞的37.5%。这些灵敏度不同的原因在于每个膀胱癌尿液标本中mR-NA的丰度无法保证。尿液标本中具有高灵敏度和特异性的BC相关miRNA生物标志物已经得到共识[13]。miRNA与mRNA不同，尽管方法学一致，都是无创的，简易的荧光定量PCR的检测方式，但是在患者来源的体液标本中miRNA的生物学结构（19-22nt）决定了其作为生物标记物小分子的优势，因为其具有更强的稳定性，更高的基因丰度和更容易达到PCR检测的要求[14]。

在BC组织或者细胞发生转录状态的改变时，往往带来miRNA分子标志物的变化，部分变化的miR-NA分子标志物会在尿液中得到体现，然而在尿液中miRNA的纯度和丰度必须达到一定的量才能进行PCR检测，而且要排除尿液样本的异质性，即每份样本中介质含量各不相同，这影响了miRNA提取，因此每个样本的miRNAs含量差异较大，想要达到应用于临床的标准必须确保实验的重复性和可靠性。本研究采用晨尿7mL，以加入异硫氰酸胍制备裂解液的形式统一保存，经过miRNA富集提取，以U6的含量均一化样本间miRNA本底水平，优化PCR条件，筛选到miR-152可作为内源性参照进行分析，这与Hanke等[15]在尿液检测miRNA的相关实验内参选择一致。上机检测发现miR-126、miR-182和miR-146a在BC全尿中含量水平较高，组间具有差异性，证明这三个miRNA可用于BC的无创检测。

陆阳等[16]对尿液（初步离心除去沉淀）中miR-143、miR-133a的相对表达量在BC诊断中的价值进行分析发现，尿液miRNA143相对表达量诊断BC的AUC为0.827，敏感性为72.70%，特异性为80.80%，尿液miRNA133a相对表达量诊断BC的AUC为0.846，敏感性为75.00%，特异性为85.40%，其或许可作为辅助诊断BC的生物标志物。然而此研究采用的尿液miRNA143和miRNA133a呈低表达，本研究针对高表达miRNA的诊断价值进行探索，因为高表达的miRNA其基因丰度相对较高，易于建立稳定的方法。阎家骏等[17]收集尿沉渣测定BC患者miR-145/miR-142比值，结果显示AUC值为0.755。因为尿液中提取的RNA是综合性质的，有游离的循环RNA，还必须考虑到尿液中相关细胞的RNA，不仅含有肿瘤细胞，还含有凋亡细胞坏死细胞以及非恶性脱落的尿路上皮细胞和白细胞，这些介质带来的影响不能完全认为和肿瘤密切相关。对尿液中的miRNA用于检测BC的研究进行荟萃分析表明，尿沉渣中多种miRNA的BC检测灵敏度最高（86.6%），随机尿中获得的多个miRNA组合检测的特异性最高（85.3%），单独miRNA与多个miRNA组合之间存在显着差异，而用于测试的样本（尿液，上清液，沉淀物）之间没有差异[18]。本研究采用7mL中段晨尿，抽提总RNA，探讨了CtmiR-126/CtmiR-152、CtmiR-182/CtmiR-152、CtmiR-146a/CtmiR-152的比值作为临床标记物应用于BC的诊断的价值评估，结果发现CtmiR-182/CtmiR-152的AUC值最高为0.8875，特异性80.00%，灵敏性83.33%,CtmiR-146a/CtmiR-152的AUC值为0.8625,CtmiR-126/CtmiR-152的AUC值为0.7917；但是如果合并了尿路感染的患者，CtmiR-182/CtmiR-152AUC值则下降到了0.7837,CtmiR-146a/CtmiR-152下降到了0.7421,CtmiR-126/CtmiR-152最低仅有0.6151。miR-126并在人内皮细胞（ECs）和浆细胞样树突状细胞（pDCs）中高度表达，在稳定状态下预处理宿主对病原体感染的反应能力，参与血管生成、癌症以及先天免疫应答[19]。miR-146a参与控制免疫系统和肿瘤发生中起双重作用[20]。因此感染患者的加入不可避免的降低了CtmiR-146a/CtmiR-152和CtmiR-126/CtmiR-152诊断的特异性和灵敏性。

总之，在泌尿系统疾病中，尿液作为最佳的非侵入性来源已被确定为液体活检的一种类型，很可能很快将成为常规临床实践[21]。本研究CtmiR-182/CtmiR-152比值的诊断价值评价已经接近于一些公认的诊断水平，如NMP22的BC检测，灵敏度34.6%～100.0%，特异性60.0%～95.0%[22]。相信随着医院采样系统和尿液处理的全自动化，以及稳定的RNA提取手段，以miRNA为技术的检测手段，可以应用到膀胱癌的常规检测中。

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基金:宁夏医科大学总医院校级课题(XY2017163);宁夏青年科技人才托举工程项目(2017)