膀胱癌是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，发病率逐年增加[1]。非整倍性是肿瘤发生的原因之一，有丝分裂纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint, SAC)复合体是保证细胞周期中染色体正确分离的重要机制之一，SAC功能异常的细胞不能检测染色体是否排列在赤道板上并建立正确的双极定向，可使细胞提前进入分裂后期，产生染色体数目异常的子细胞，进而引发肿瘤等疾病[2,3,4,5,6]。BubR1又称BUB1B,是SAC复合体的主要蛋白，在溃疡性结肠炎相关的结直肠癌和膀胱癌中呈高表达，且BubR1高表达与病理分期晚、肿瘤复发和疾病进展相关[7,8]。本研究探讨敲减BubR1表达对膀胱癌UMUC3细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响，报道如下。

1、材料与方法

1.1 一般材料

膀胱癌UMUC3细胞购自中国科学院上海生命科学研究院。特异性shRNA-BubR1套餐(shRNA-BubR1-1 序列为5′-GAGUGAUCACGAUUUUUAAAUCAGA-3′,shRNA-BubR1-2序列为5′-GUCUCACAGAUUGCUGCCUCAGAGC-3′,shRNA-NC序列为 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)(吉玛基因股份有限公司);Applied Biosystems 7500型PCR仪，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,转染试剂盒(美国Thermo Fisher公司);酶标仪(美国BioRad公司);兔抗人BubR1一抗，Transwell小室(美国Sigma公司);LAS-4000I成像系统(日本Cytiva公司);BCA蛋白定量试剂盒，cDNA反转录试剂盒，TB Green® Premix Ex TaqTM 试剂盒(北京宝日医生物科技公司);Tanon-5200型分光光度仪，ECL化学发光试剂盒(上海天能科技有限公司);Trizol试剂盒(北京天根生化科技公司);DM2500LED光学显微镜(德国Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 数据库信息收集

自TCGA数据库收集19例膀胱癌患者癌组织与癌旁组织标本的BubR1 mRNA表达数据，并进行比较。自GEO数据库收集165例膀胱癌患者的癌相关基因GSE13507芯片数据及临床数据，其中表浅型膀胱癌103例，侵袭性膀胱癌62例；低级别膀胱癌105例，高级别膀胱癌60例；早期(Ta～T1期)104例，晚期(T2～T4期)61例。以165例患者癌组织BubR1 mRNA相对表达量均值为界，比较高表达(BubR1 mRNA相对表达量≥8.68),与低表达(BubR1 mRNA相对表达量<8.68)者的总体生存率和特异性存活率(带瘤存活患者的生存率)。

1.2.2 UMUC3细胞复苏及培养

冻存的UMUC3细胞37 ℃水浴复苏，放入含体积分数10% FBS的DMEM培养瓶中，37 ℃、体积分数5%CO2培养箱培养。显微镜下观察细胞融合度达90%时传代培养，取第3代对数生长期细胞，采用慢病毒感染的方法构建稳转细胞株[9]。

1.2.3 细胞分组及转染

将构建的稳转细胞株分为空白组、转染1组、转染2组，应用含体积分数10% FBS的DMEM培养基调整细胞密度为2×105/mL,以每孔1×104个接种于6孔板，每组设3个复孔。空白组转染shRNA-NC,转染1组转染shRNA-BubR1-1,转染2组转染shRNA-BubR1-2。严格按照转染试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 BubR1 mRNA相对表达量检测

采用实时荧光定量PCR法。转染48 h取3组细胞，PBS冲洗后，每孔加入500 μL Trizol试剂提取细胞总RNA,分光光度仪检测总RNA浓度和纯度合格后，应用反转录试剂盒反转录为模板cDNA。应用PCR仪及TB Green® Premix Ex TaqTM试剂盒进行PCR扩增。PCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 7.5 μL,模板DNA 1 μL,上游引物0.6 μL,下游引物0.6 μL,ROX Reference Dye or Dye Ⅱ 0.3 μL,DEPC水5.6 μL。PCR反应条件：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 3 s, 60 ℃ 30 s, 40个循环；65 ℃ 10 s。引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.2.5 BubR1蛋白相对表达量检测

采用Western blot法。转染48 h取3组细胞，蛋白裂解液充分裂解，冰上反应30 min, 4 ℃,13 400×g离心10 min取上清液即为细胞蛋白。BCA法检测蛋白浓度，4 ℃预冷的PBS溶液将样本稀释至一致浓度后，以1:4的比例加入5×浓缩蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴8 min使其变性，冷却至常温后行SDS-PAGE电泳(恒压120 V,80 min),湿转至PVDF膜(恒流200 mA,80 min);TBST洗膜5 min×3次，质量分数5%脱脂奶粉封闭1 h; TBST洗膜5 min×3次，加入BubR1一抗(1■5 000)、actin一抗(1■20 000),4 ℃孵育过夜；去除一抗，TBST冲洗5 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1■10 000),室温孵育1 h; 去除二抗，TBST洗膜5 min×3次，加入ECL化学发光底物1 h内闭光显色。应用LAS-4000I成像系统检测，应用Image J软件进行半定量分析。选择敲减效率高的转染2组细胞进行后续实验。

1.2.6 细胞增殖能力检测

采用细胞计数法。取空白组、转染2组细胞， 以2×104个/孔铺在6孔板中(每组设3个复孔),约8 h细胞全部贴壁后计数细胞，记为第0天作为校正数据。然后连续5天收集细胞进行计数。每孔重复计数3次取均值。计算第1～5天与第0天细胞数的差值为增殖细胞数。

1.2.7 细胞迁移能力检测

采用细胞划痕实验。取空白组、转染2组细胞，应用含体积分数10% FBS的DMEM培养基调整细胞密度为2×105/mL,以每孔2×104个接种于6孔板(每组设3个复孔),接种后12～24 h细胞融合度达到100%。细胞铺板后放入37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中培养至细胞贴壁，用200 mL移液器枪头垂直于6孔板底部均匀划横线，每孔3条线；PBS冲洗3次，清除细胞碎片；加入无血清DMEM培养基，显微镜下拍摄0 h图像后，置于37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中继续培养。分别于培养12、24 h光学显微镜下观察并拍照。应用Image J软件计算细胞划痕宽度。

1.2.8 细胞侵袭能力检测

采用Transwell小室实验。用50 mg/L Matrigel胶1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，37℃培养箱中孵育3 h, 使基质胶聚合成薄膜。使用时吸去上室中多余液体，每孔加入100 μL无血清DMEM培养基，放置30 min使基底膜水化。取空白组、转染2组细胞，质量分数0.5%胰蛋白酶消化，300×g离心3 min弃去培养液，PBS洗涤3 min×2次，无血清DMEM培养基重悬，调整细胞密度为3×105/mL,取100 μL细胞悬液加入Transwell上室。24孔板下室加入600 μL含体积分数10%FBS的DMEM培养基，37℃、体积分数5%CO2培养箱培养16 h。取出Transwell小室，吸干上室液体，棉签拭去上室未能穿过滤膜的细胞，PBS清洗5 min×3次，甲醇固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶ 1)固定30 min; 加入600 μL 的质量分数0.1%结晶紫染色液，室温染色15 min; ddH2O漂洗5 min×3次，棉签拭去上室内侧细胞。晾干后显微镜下拍照，随机取5个视野观察，记录侵袭细胞数。

1.3 统计学处理

应用SPSS 19.0软件进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差(x¯±s)

表示，2组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析；计数资料比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，总体生存率、特异性存活率比较采用log-rank检验；检验水准α=0.05.

2、结 果

2.1 膀胱癌组织与癌旁组织BubR1mRNA相对表达量比较

19例膀胱癌患者癌组织BubR1相对表达量(7.00±0.76)高于癌旁组织(1.22±0.38)(t=6.803,P<0.001)。见图1。

图1 19例膀胱癌患者癌组织与癌旁组织的BubR1相对表达量

2.2 GSE13507芯片分析结果

165例膀胱癌患者BubR1 mRNA相对表达量在膀胱癌组织高于癌旁组织，侵袭性膀胱癌高于表浅性膀胱癌，高级别膀胱癌高于低级别膀胱癌，晚期膀胱癌高于早期膀胱癌(P<0.05)。以165例患者癌组织BubR1 mRNA相对表达量均值为界，78例高表达者总体生存率(42.21%)、膀胱癌特异性存活率(70.50%)均低于87例低表达者(56.78%、83.26%)(P<0.001)。见表2,图2。

表2 不同病理特征的膀胱癌患者BubR1 mRNA相对表达量比较 (x¯±s)

图2 BubR1高表达与低表达者生存曲线图  

2.3 空白组、转染1组、转染2组BubR1mRNA及蛋白相对表达量比较

空白组、转染1组、转染2组BubR1 mRNA及蛋白相对表达量比较差异均有统计学意义(P<0.05)。转染1组、转染2组BubR1 mRNA及蛋白相对表达量均低于空白组(P<0.05),转染2组均低于转染1组(P<0.05)(表3,图3)。取敲减效率高的转染2组和空白组细胞进行后续实验。

表3 空白组、转染1组、转染2组BubR1 mRNA及蛋白相对表达量比较组

图3 空白组、转染1组、转染2组BubR1蛋白表达的Western blot图

2.4 空白组与转染2组增殖细胞数比较

转染2组培养第4、5天增殖细胞数均少于空白组(P<0.05),第1、2、3天增殖细胞数与空白组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 空白组与转染2组增殖细胞数比较

2.5 空白组与转染2组细胞划痕宽度比较

转染2组培养12、24 h细胞划痕宽度大于空白组(P<0.05),培养0 h细胞划痕宽度与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5,图4。

表5 空白组与转染2组细胞划痕宽度比较

图4 空白组、转染2组细胞划痕实验图   

2.6 空白组与转染2组侵袭细胞数比较

转染2组侵袭细胞数[(66.67±7.53)个]少于空白组[(122.30±7.84)个](t=5.120,P=0.007)。见图5。

图5 空白组、转染2组结晶紫染色图

3、讨 论

人BubR1基因由1 050个残基构成，编码蛋白的N-末端(残基1～426)覆盖酵母Mad3保守序列的大部分，C-末端(残基730～1050)覆盖丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。N-末端是真核生物中高度保守的区域，参与着丝粒结合和检查点信号转导；中间区域和C-末端参与促进稳定的着丝粒-微管附着，是SAC的一个关键组成部分[10]。

肿瘤的形成与细胞周期调控异常密切相关，有丝分裂期间正确的染色体分离主要依赖于SAC的功能来感知动粒微管的附着状态，阻止纺锤体装配不完全或发生错误的中期细胞进入后期。SAC 是监控细胞周期运行的主要检测点，主要通过协调姐妹染色单体动力学与有丝分裂纺锤体的正确连接，并激活后期促进复合物/环体(APC/C)和E3泛素连接酶启动染色体分离[11]。有丝分裂检查点复合物(mitotic checkpoint complex, MCC)由BubR1、Bub3、Cdc20和Mad2共同组成[12],能与未连接的动粒微管产生互作，通过抑制APC/C进而延迟染色体分离[13]。BubR1为MCC的主要功能蛋白，通过一个保守的基序招募蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A, PP2A)调节亚基B56家族(PP2A-B56)到着丝粒外侧，降低外侧微管结合蛋白的磷酸化水平，拮抗着丝点上的Aurora B激酶的活性，建立稳定的着丝粒与微管附着[14]。BubR1结合的PP2A还可破坏Bub1和有丝分裂抑制缺陷蛋白1间的相互作用，能稳定动粒微管与极微管之间的附着[15]。因此，BubR1是SAC信号级联反应的关键调节蛋白之一，参与调控细胞周期和DNA损伤修复等过程，与肿瘤的发生关系密切[16],但其参与肿瘤形成的机制尚未完全阐明。

有研究[17]表明，BubR1+/-小鼠胚胎成纤维细胞在纺锤体检查点激活方面存在缺陷，securin和Cdc20显著减少，应用致癌物DMBA处理后可迅速发展为肺癌和肠癌。文献[18]报道，BubR1+/-ApcMin/+复合突变小鼠的结肠肿瘤发生率是ApcMin/+小鼠的10倍。

BubR1过表达与多种恶性肿瘤的发生、进展有关。 BUB1B高表达的原发性肝癌患者生存率较BUB1B低表达者差，沉默BUB1B表达后肝癌HepG2细胞的增殖、侵袭能力减弱[17]。生物信息学研究结果[18]显示，BUB1B是乳腺癌远处转移风险的关键基因，与较差的远端无转移生存显著相关。Yan等[19]研究表明，甲状腺癌组织中BubR1表达明显增高，BubR1高表达者无进展生存期缩短，敲低BubR1表达可抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移，促进癌细胞凋亡。Tang等[20]报道，多发性骨髓瘤患者BubR1表达增加，过表达BubR1促进细胞增殖并诱导体外和体内耐药，其机制是BubR1通过磷酸化CEP170来诱发染色体不稳定性。研究结果[21]显示，肺腺癌患者BUB1B表达上调，BUB1B高表达者的生存时间较BUB1B低表达者缩短，敲除BUB1B可抑制细胞增殖、迁移和侵袭。有学者[22]报道，胰腺导管腺癌组织中BUB1B高表达与较差的总生存期、无病生存率显著相关。Yamamoto等[23]研究表明，尿路上皮性膀胱癌患者癌组织BUBR1过表达与较高的组织学分级、较晚的病理分期和较高的细胞增殖相关，BUBR1过表达可预测肿瘤复发和疾病进展。本研究结果显示，膀胱癌组织BubR1 mRNA相对表达量高于癌旁组织，表明膀胱癌组织BubR1表达增高；BubR1表达在膀胱癌组织高于癌旁组织，侵袭性膀胱癌高于表浅性膀胱癌，高级别膀胱癌高于低级别膀胱癌、晚期膀胱癌高于早期膀胱癌，表明BubR1表达与膀胱癌病理分级、侵袭程度和临床分期呈正相关；BubR1高表达组总体生存率、特异性存活率低于低表达组，提示BubR1高表达的膀胱癌患者预后不良，与文献[23]报道一致。

本研究进一步采用shRNA技术敲减膀胱癌UMUC3细胞BubR1表达，结果显示转染2组培养第4、5天增殖细胞数少于空白组，培养12、24 h细胞划痕宽度大于空白组，侵袭细胞数少于空白组，提示敲减BubR1后膀胱癌细胞增殖，迁移及侵袭能力均减弱，BubR1可促进膀胱癌的发生发展，其可能机制是BubR1高表达导致SAC缺陷和基因组不稳定[23]。

本研究结果提示，BubR1在膀胱癌中呈高表达，敲减BubR1表达可抑制膀胱癌UMUC3细胞增殖、迁移及侵袭，BubR1过表达可预测膀胱癌复发和疾病进展，BubR1可能是潜在的膀胱癌治疗靶点。但BubR1参与调节膀胱癌细胞增殖、迁移及侵袭的机制尚需进一步研究。

参考文献:

[9]颜秋霞,曾鹏,黄树强,等.RBMX通过下调PKM2抑制膀胱癌细胞的增殖､迁移､侵袭和糖酵解[J].南方医科大学学报,2024,44(1):9-16.

[10]周艳萌,向晓波,王欢.siRNA干扰HepG2.2.15细胞BUBR1基因及对细胞增殖的影响[J].遵义医科大学学报,2020,43(6):703-708.

[17]周岩,母汉友,王淑芬,等.BUB1B在原发性肝癌中的表达及对肝癌细胞增殖和侵袭的影响[J].新医学,2019,50(4):272-277.

文章来源:董丰铭,刘屹立.敲减BubR1表达对膀胱癌UMUC3细胞生物学行为的影响[J].中华实用诊断与治疗杂志,2024,38(07):668-673.