缺血性脑卒中是由于脑供血动脉急性闭塞或严重狭窄，脑供血不足所致的局部脑组织坏死性疾病，具有高致残率、高致死率的特点，严重威胁老龄人口的生命健康[1,2]。血管再通疗法虽可部分恢复脑部供血、消除有毒代谢物，亦会诱发脑水肿、加重脑组织损伤[3]。脑缺血再灌注损伤已成为脑卒中临床治疗亟待解决的问题，因此，需深入研究缺血再灌注损伤的防治策略。中医药具有多靶点、多环节、整体治疗的特点，对脑缺血的治疗发挥重要作用[4]。脑缺血再灌注损伤归属于中医学“中风”范畴，中医对该病因机证治的论述较为丰富，王清任于《医林改错·半身不遂论》记载：“半身不遂，亏损元气，是其本源……无气则不能动，不能动，名曰半身不遂”“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”,开拓性地提出“气虚血瘀”理论。现代中医研究表明，缺血性脑卒中是在气虚的基础上，风、火、痰、瘀彼此作用，相互转化而发病[5]。王永炎院士认为该病本虚标实，本虚以“气虚”多见，标实以“痰瘀”为主，并谨守中医“急则治标，缓则治本”原则，急性期侧重“化痰散瘀”,恢复期重在“益气培本”[6]。因此，气虚为缺血性脑卒中基本病机，痰浊、血瘀是该病主要致病因素及病理产物。

康益胶囊由红参、丹参、三七、土鳖虫、水蛭、大黄研末而成，具有益气活血、化痰散瘀之效，临床疗效显著[7]。前期临床研究发现，康益胶囊可上调缺血性脑卒中患者血清中脑源性神经营养因子、血管内皮生长因子及神经生长因子含量，改善缺血脑组织损伤、降低患者颅内压、提升患者生活质量[8]。实验研究表明，康益胶囊通过增强大鼠缺血侧脑组织中谷胱甘肽过氧化物酶及过氧化氢酶表达，减轻脑组织氧化损伤、改善大鼠脑水肿，亦能减少乳酸脱氢酶的释放，保护受损神经元[9]。上述研究证实康益胶囊可降低缺血侧脑含水量，但具体作用机制尚不明确，因此，本研究以脑缺血再灌注大鼠为模型，探讨康益胶囊对脑缺血后水通道蛋白(AQP)4、基质金属蛋白酶(MMP)-9蛋白的干预作用，为康益胶囊治疗缺血性脑卒中提供理论依据。

1、资料与方法

1.1动物

清洁级健康雄性SD大鼠72只，体质量(250±30)g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2019-0010。大鼠分笼饲养于河南中医药大学中心实验室清洁级动物房中，在喂养温度(22±2)℃、相对湿度(50±10)%,人工控制光照、黑暗各12 h条件下，予以Co60辐照维持饲料及去离子水饲养。所有动物实验由河南省中医院及河南中医药大学第二临床医学院伦理委员会批准后进行。

1.2实验仪器

气体麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型号：R500IF);病理切片机(德国徕卡公司，型号：RM2016);生物显微镜(日本奥林巴斯公司，型号：BX53)、生物组织摊烤片机(型号：JK-6)、脱水机(型号：JT-12J)、包埋机(型号：JB-P5)均购自武汉俊杰电子有限公司；一次性刀片(日本羽毛公司，型号：8093081);精密电子天平(上海海康电子仪器厂，型号：JA203);电热恒温干燥箱(上海恒科学仪器有限公司，型号：DHG-9023A);线栓(北京西浓科技有限公司，型号：2636A2);恒温水浴箱(上海天美科学仪器有限公司，型号：UV1000);Western印迹电泳仪(型号：1645050)、Western印迹转膜仪(型号：Mini trans-Blot17)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶系统(型号：Mini PROTEAN)、化学发光凝胶成像仪(型号：ChenmiDoc XRS+)均购自美国伯乐公司。

1.3实验试剂与耗材

异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批号：30037516);二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司，货号：P0010);CFASany KD PAGE蛋白电泳凝胶制备试剂盒Ⅰ型(陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司，货号：PE008);彩色预染蛋白(香港柯非特生物科技有限公司，货号：LBP6510-02);4×蛋白上样缓冲液(货号：P1016)、高效RIPA裂解液(货号：R0010)、电化学发光(ECL)超敏发光液(货号：PE0010)、4×蛋白上样缓冲液(货号：P1016)、2%2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色液(货号：G3005)均购自北京索莱宝科技有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore公司，货号：IPVH00010);抗AQP4抗体(武汉博士德生物公司，货号：BA1560);抗MMP9抗体(武汉博士德生物公司，货号：PB9669);羊抗兔IgG二抗(货号：SA00001-2)、抗β-actin抗体(货号：20536-1-AP)均购自武汉三鹰生物技术有限公司；苏木素(美国Sigma公司，货号：H9627);伊红Y(货号：71014544)、无水乙醇(货号：10009218)、二甲苯(货号：10023418)、盐酸(货号：10011018)、包埋石蜡(货号：69019361)、中性树胶(货号：10004160)均购自中国医药集团有限公司。

1.4药物

康益胶囊(按照人参、丹参、土鳖虫、水蛭、三七、大黄1.0∶3.0∶2.0∶1.0∶1.0∶0.8比例，中药饮片研末配制而成)、银杏叶片(扬子江药业集团有限公司，国药准字Z20027949,9.6 mg∶2.4 mg/片)购自河南省中医院药房，上述药物均由100℃沸水制备悬浊液，常温冷却，4℃贮藏备用。

1.5制备模型

参照文献造模方法[10],应用线栓法制备大鼠左侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。术前所有大鼠禁食12 h,自由饮水，5%异氟烷气体吸入麻醉大鼠，将麻醉大鼠以仰卧位固定于手术板，备皮后，在大鼠颈部正中线开口，逐层钝性分离，暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA),分离CCA与迷走神经，并在CCA近心端、ECA近“Y”口分叉处、ICA远心端各备一根手术线备用，结扎CCA、ECA并用动脉夹夹闭ICA,距ICA、CCA分叉处4 mm位置，以眼科剪在CCA剪一“V”形切口，将尼龙线栓[长度45 mm,头端直径(0.36±0.02)mm]半球端由切口插入ICA,向前缓慢推进17～20 mm,略遇阻力为止，记录时间。结扎ICA以固定栓线，逐层消毒缝合手术开口，栓线残端1 cm留于皮外，1.5 h后拔出线栓球端，恢复左侧脑部血供，假手术组大鼠只作分离，不插入线栓。造模室温24～25℃,大鼠体温36.5～37.5℃。

根据Zea-Longa五分法评分标准[11],术后24 h对大鼠进行神经行为学评分。评分标准：0分，行为正常，无神经功能缺损；1分，提尾不能完全伸展右侧前爪；2分，提尾右侧前肢内收，爬行右侧转圈；3分，站立不稳，向右侧跌倒；4分，意识障碍，不能行走。保留1～3分大鼠，剔除0分、4分大鼠。

1.6分组与给药

采用随机数字表法将SD雄性大鼠分为假手术组、模型组、康益胶囊低、中、高剂量组、银杏叶组，每组12只。根据成人标准体质量每日摄入总量3 g,依据人与大鼠之间用药剂量换算系数表计算大鼠用药量[12],配制康益胶囊中剂量组(540 mg/kg)、低剂量组(270 mg/kg)、高剂量组(1 080 mg/kg),银杏叶组(680 mg/kg),假手术、模型组则给予同等体积的溶剂。在左侧大脑恢复血供后24 h后行灌胃给药，每日按时1次，持续给药14 d。

1.7观察指标

1.7.1改良神经功能缺损评分(mNSS评分)[13]

mNSS评分评价脑缺血大鼠神经功能缺损情况，评分项目包含感觉、运动、平衡及反射功能等多个方面，全面评估脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损恢复情况，总评分为18分，脑损伤与分值呈正比，评估选择术后第1、3、7、14天，固定相同时间节点进行。

1.7.2脑水肿测定

灌胃14 d、评分结束后，于各组随机选取6只大鼠，气麻后处死，断头取脑，舍弃嗅球、小脑及小脑旁绒球，以生理盐水冲洗大脑表面血渍，滤纸吸附表面水分后，称取脑组织湿重质量，将大脑在100℃烘箱中干燥24 h,再称取脑组织干重质量。脑含水量百分比按照脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%计算。

1.7.3 TTC染色测定脑梗死面积

脑水肿测定完成后，麻醉处死各组剩余6只大鼠，迅速断头取出完整大脑，生理盐水冲洗后，吸干表面水分，置于-20℃冰箱冷冻30 min,将冻硬大脑置于大鼠脑切片模具中，在脑视交叉前后1 mm处，作冠状切片，在2%TTC染色液中，37℃避光孵育30 min,期间翻片，确保染色充分，随后浸泡于10%多聚甲醛固定，缺血脑组织呈白色，正常脑组织呈红色，应用Image Pro Plus计算切片脑梗死面积，脑梗死面积百分比=(梗死面积/全脑总面积)×100%。

1.7.4苏木素-伊红(HE)染色法检测病理变化

TTC染色完成后，将每组6只大鼠缺血侧大脑组织视交叉至枕极部分，置于10%甲醛溶液固定，先使用梯度酒精对脑组织进行脱水处理，后经二甲苯透明处理，再由60℃石蜡浸泡，最后使浸蜡组织块包埋于蜡块中。使用蜡块制备5μm厚度的石蜡切片，经切片脱蜡、苏木素染色10 min、分化液分化、返蓝液返蓝、伊红复染、去离子水水洗、脱水、透明、风干、封片、镜检。

1.7.5 Western印迹法检测AQP4、MMP-9蛋白表达

取各组剩余大鼠缺血侧脑组织脑前极至视交叉部分，将脑组织置于裂解液中，在匀浆机1 500 r/min、8 min中匀浆，提取上清液，BCA试剂盒对蛋白浓度定量，加入1×蛋白质上样缓冲液，在100℃水浴加热5 min,使蛋白变性，配胶、上样进行电泳分离蛋白，后将凝胶蛋白印迹转印至PVDF膜中，用5%脱脂奶粉封闭1 h,在4℃冰箱一抗(AQP4,1∶1 000;MMP-9,1∶1 000;β-actin, 1∶2 000)孵育过夜。Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)清洗5 min,重复5次后，二抗羊抗兔IgG(1∶3 000)孵育1 h, TBST清洗5次后，使用超敏发光液在凝胶成像仪中检测蛋白印迹，而后使用Image J软件量化目的蛋白条带的灰度值，并以β-actin作为内参蛋白，对比分析目的蛋白表达。

1.8统计学方法

采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用LSD法检验，统计标准α=0.05。

2、结果

2.1各组mNSS评分结果

如表1所示，假手术组无神经功能缺损症状，剩余各组均呈现神经功能缺损。与假手术组相比，各时间点模型组均有明显神经功能缺损(P<0.01)。与模型组相比，康益胶囊低、中剂量组灌胃第1天无显著差异(P>0.05),其余时间点治疗组均显著改善神经功能缺损(P<0.01)。与康益胶囊低剂量组相比，各时间点高剂量组、银杏叶组治疗效果均显著(P<0.05)。与康益胶囊中剂量组相比，各时间点高剂量组效果明显(P<0.05)。灌胃第14天，康益胶囊高剂量组治疗效果与银杏叶组存在显著差异(P<0.05)。治疗组均能改善MCAO大鼠神经功能缺损，且康益胶囊高剂量组治疗效果优于其余各组。

1.402)3)4)

银杏叶片组13.33±1.072)3)11.83±0.942)3)4)10.75±1.142)3)4)9.08±1.562)3)4)5)

与假手术组比较：1)P<0.01;与模型组比较：2)P<0.01;与康益胶囊低剂量组比较：3)P<0.05,与康益胶囊中剂量组比较：4)P<0.05;与康益胶囊高剂量组比较：5)P<0.05

2.2各组脑含水量及脑梗死面积比较

如表2所示，与假手术组相比，模型组脑组织含水量及脑梗死面积明显上升(P<0.01);与模型组相比，康益胶囊低、中、高及银杏叶片组脑组织含水量及脑梗死面积明显下降(均P<0.01);与康益胶囊低剂量组相比，康益胶囊中、高及银杏叶片组脑组织含水量及脑梗死面积显著减少(均P<0.01);与康益胶囊中剂量组相比，康益胶囊高剂量组和银杏叶片组脑组织含水量及脑梗死面积显著下调(均P<0.05)。与康益胶囊高剂量组相比，银杏叶组脑梗死面积百分比显著升高(P<0.05)。康益胶囊可改善大鼠脑缺血损伤，且高剂量组治疗效果较好。治疗组均能改善MCAO大鼠脑水肿，而康益胶囊高剂量组效果最佳。如图1所示，假手术组脑切片呈红色，未见梗死区域；模型组脑切片缺血侧出现大面积白色梗死区，治疗组相比模型组梗死面积均减少，说明康益胶囊和银杏叶片可改善大鼠脑缺血损伤。

2.3各组脑组织病理形态变化

如图2所示，假手术组脑皮层神经元结构及形态完整，胞膜完整，胞浆充盈，核仁清晰；模型组神经细胞结构改变，皮质区广泛水肿，细胞间隙增大，部分细胞肿胀，核仁固缩或变浅，细胞数目明显减少；与模型组相比，治疗组缺血侧脑组织随着中药剂量的增加，水肿减轻，神经细胞形态改善、数目增加，细胞肿胀及核固缩、溶解减轻，其中康益胶囊高剂量组脑组织损伤较为轻微。

图1各组脑组织缺血(TTC染色)   

图2各组脑组织病理形态(HE染色，×400)   

2.4各组脑组织AQP4及MMP-9蛋白表达

如图3、表3所示，与假手术组相比，模型组脑组织AQP4及MMP-9蛋白表达显著上升(均P<0.01);与模型组相比，各治疗组脑组织AQP4及MMP-9蛋白表达均显著降低(均P<0.01)。

图3各组AQP4、MMP-9蛋白表达  

1) 与假手术组比较，2)与模型组比较，3)与康益胶囊低剂量组比较，4)与康益胶囊中剂量组比较：均P<0.01

3、讨论

脑缺血再灌注损伤是复杂、多因素过程，由于动脉栓塞或狭窄致使缺血脑组织能量衰竭、去极化和兴奋性损伤，导致细胞毒性及血管源性水肿，继而诱发神经元死亡[14,15]。缺血性脑水肿通常由细胞毒性水肿引起，而后发展为血管源性水肿，且伴有广泛性脑损伤[16]。细胞毒性水肿是由于细胞膜上钠、钾泵功能受损导致离子失衡，水分向胞内迁移、聚集，最终诱发细胞水肿。而星形胶质细胞是细胞毒性水肿的主要类型，反应性星形胶质细胞通过释放血管生成因子，该因子在中枢神经系统内皮细胞中传递抑制信号，下调紧密连接蛋白及闭合蛋白的表达，破坏血脑屏障[17,18]。血管源性水肿是血脑屏障破坏的结果，血脑屏障通透性增加导致离子和蛋白质进入血管外空间，水分子顺浓度梯度渗透、聚集于大脑间质，诱发脑水肿[19]。

AQP4是一种疏水性跨膜小分子单体，在脑血管周围星形胶质细胞终足中表达，并通过参与水分子通过血脑屏障的运动，控制神经系统的水稳态[20,21]。研究表明，脑缺血发生后，AQP4在反应性星形胶质细胞中高表达，促进该细胞迁移，而反应性星形胶质细胞迁移导致细胞内外渗透压改变，AQP4在星形胶质细胞前端片脂中发生极化，水分子流入胞内，导致细胞毒性水肿[22]。此外，由AQP4介导的星形胶质细胞肿胀可促进谷氨酸兴奋性毒性、一氧化氮产生及细胞因子如：白细胞介素(IL)-1β、IL-6及肿瘤坏死因子-α的释放，从而加重缺血区血脑屏障损伤，诱发脑水肿[23]。因此，AQP4在血脑屏障周围星形细胞终足的优先表达，对脑缺血再灌注损伤性水肿的治疗，具有重要意义。

MMP-9是一种活性部位含有锌离子的内肽酶，可消化细胞外基质成分包括层黏连蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖，在脑缺血再灌注过程发挥作用[24]。脑组织缺血区域MMP-9表达增强，通过降解细胞外基质提高血脑屏障的通透性，从而促进血管源性脑水肿，增加炎症细胞浸润，促进炎症反应和凋亡，从而加剧脑缺血再灌注损伤[25,26]。实验研究表明，在局灶性脑缺血模型中，MMP-9基因缺陷小鼠相比普通小鼠，具有较强的血脑屏障保护作用[27]。临床研究发现，脑梗死患者梗死核心及缺血半暗带区域中MMP-9表达明显上调，在梗死核心区，表达于浸润的中性粒细胞及活化的小胶质细胞，而在缺血半暗带区，主要表达于巨噬细胞，表明MMP-9与缺血性脑损伤和继发性脑水肿密切相关[28]。因此，抑制MMP-9的表达可减轻血脑屏障功能障碍及缺血性脑损伤。

综上所述，脑缺血再灌注可导致脑组织损伤、神经功能障碍、脑水肿，同时伴有血脑屏障通透性增加、炎症因子浸润、神经细胞凋亡等病理改变[29]。本研究结果说明，康益胶囊具有改善脑缺血再灌注损伤，抗脑水肿的作用。康益胶囊可改善脑缺血再灌注损伤、降低继发性脑水肿，发挥脑保护作用，但脑缺血再灌注损伤病理机制复杂，康益胶囊作用机制是否与炎症级联反应、细胞凋亡有关及对血脑屏障的保护机制，有待深入研究。

参考文献:

[1]于潇,王贵阳,侯宇东,等.中药抗脑缺血再灌注损伤的作用及其机制的研究进展[J].中草药,2021;52(5):1471-84.

[2]于少泓,李万斌,刘昭纯.基于中风“气虚生痰､瘀阻脑络"病机假说的数据挖掘[J].中国中医基础医学杂志,2018;24(11):1514-6.

[3]陈慧亭,崔应麟.康益胶囊治疗气虚血瘀型缺血性中风恢复期的临床观察[J].中医药通报,2018;17(2):48-50.

[4]张文涛,崔应麟,郑伟锋,等.康益胶囊联合常规治疗对缺血性中风急性期患者的临床疗效[J].中成药,2021;43(6):1676-9.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(81573919);河南省科技攻关项目(212102311123);河南省中医药研究专项课题(2019ZY2003,2017ZY1020);

文章来源:张奎明,葛鸾蝶,崔应麟等.康益胶囊对缺血再灌注脑水肿大鼠脑组织AQP4､MMP-9蛋白的影响[J].中国老年学杂志,2023,43(16):3954-3960.