脓毒症继发多器官功能损伤是重症监护室患者死亡的主要原因，其中脓毒症急性肺损伤（acute lung injury,ALI）占50%以上[1]，其发病机制与炎症因子浸润、毛细血管通透性增加导致的肺泡与肺间质水肿相关。此外，机体的氧化应激产物也参与了脓毒症ALI的发生与发展，其病理生理机制尚不清楚。越来越多的证据表明，铁死亡在调节脓毒症继发ALI中发挥重要作用，并可能成为ALI的潜在治疗靶点[2-5]。铁死亡是一种以细胞内铁超载和脂质过氧化物累积导致的细胞死亡，不同于细胞凋亡、自噬与其他形式的死亡。在防止脂质过氧化介导的铁死亡过程中，谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathi⁃one peroxidase 4,Gpx4）是一种重要的脂质修复酶，参与炎症调节、铁死亡等多种信号通路。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2）的激活上调Gpx4表达，降低细胞内氧化应激反应抑制铁死亡。姜黄素是一种天然黄色多酚类脂溶性化合物，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基等多种功效，对脓毒症动物模型器官具有保护作用[6-7]。已有研究表明铁死亡可直接诱导脓毒症ALI的发生，但是姜黄素对铁死亡的干预机制尚不明确[8-9]，为此，本研究通过盲肠结扎穿孔术（cecalligationand puncture,CLP）构建大鼠脓毒症ALI模型，探究姜黄素对脓毒症大鼠ALI的干预作用及Gpx4介导的铁死亡机制。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

选取SPF级雄性SD大鼠24只，体质量280～300 g，购于大连医科大学动物中心。实验动物使用许可证号：SYXK（辽）2018-0007，生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001。所有动物实验经大连医科大学实验动物伦理委员会审批（编号：AEE22098）。

1.1.2 主要试剂

姜黄素购于Sigma公司；MDA、GSH、Fe2+检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-6、IL-1β检测试剂盒均购于武汉华美有限公司；兔源一抗Nrf2、Gpx4、GAPDH及羊抗兔IgG二抗均购于Abcam公司；原位缺口末端标记法（TUNEL）凋亡检测试剂盒购于Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制备

采用CLP制备大鼠脓毒症ALI模型，随机分为3组：Sham组、Sepsis组、Cur组，每组8只。采用1%戊巴比妥钠（60 mg/kg）腹腔注射麻醉后在腹部正中切开长约1.0 cm切口，剪开腹膜，找到盲肠并牵出腹腔，距离盲肠根部1/3处结扎，在盲肠末端用20G针头穿过3次，粪便流至腹腔，之后还纳肠管，逐层关腹，按照失血量皮下注射生理盐水（补液量5.0 ml/kg）。Sham组仅行开关腹手术，Cur组在术后1 h腹腔注射姜黄素（二甲基亚砜为溶剂）200 mg/kg,24 h后重复给药1次，术后大鼠分笼饲养，自由进食水，48 h处死大鼠取肺组织备用。

1.2.2 肺组织湿/干重（W/D）测定

建模成功后48 h腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后处死大鼠，取右肺上叶，滤纸吸干肺表面水分及血迹，称量湿质量（W）；然后置于80℃烤箱内烘干48 h，称量干质量（D），计算W/D。

1.2.3 肺组织病理情况及损伤程度评分

切取左肺组织置于4%多聚甲醛中固定24 h，乙醇逐级脱水，石蜡包埋备用。切取5µm厚度切片，脱蜡后水化、HE染色、封片。在光镜下观察肺泡与肺间质水肿、出血、炎症细胞浸润程度、肺不张与肺透明膜形成等对肺组织进行损伤程度评分，评价建模是否成功。评分标准[10]:0分，无损伤；1分，轻度损伤（<25%);2分，中度损伤（25%～50%);3分，重度损伤（51%～75%);4分，极重度损伤（>75%）。

1.2.4 肺组织中MDA、GSH、Fe2+含量测定

取左肺组织投入液氮中快速冷却，将其研磨成粉末状称重，按照重量（g）和体积（ml)1∶9加入预冷的生理盐水充分混匀，以2 000 r/min离心20 min，取上清液以备检测。按照试剂盒说明书添加样品及工作液，混匀后离心上样检测各自吸光度，绘制标准曲线计算MDA、GSH、Fe2+的含量。

1.2.5 肺组织中TNF-α、IL-6、IL-1β含量测定

取左肺组织进行匀浆，以3 000 r/min离心15 min，取上清液按照试剂盒说明书进行操作，采用全自动酶标仪测定450 nm处的吸光度值，通过绘制标准曲线计算肺组织中TNF-α、IL-6、IL-1β的浓度。

1.2.6 Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡检测

将肺组织切片，每组6张，依次经过二甲苯透明、乙醇脱水、蛋白酶K室温反应15 min、10%甲醛固定、乙醇乙酸浸润、3%过氧化氢浸润、TdT酶缓冲溶液孵育5 min、终止液终止反应20 min、过氧化酶标记物抗体孵育20 min、DAB显色30 min、无水乙醇和二甲苯固定、晾干、封片，于荧光显微镜下观察凋亡细胞（棕色或棕黄染色为阳性），每张切片观察8个视野（×200），计算凋亡细胞数占总细胞数的百分比为凋亡指数（apoptotic index,AI）。

1.2.7 Western blot检测肺组织中Nrf2、Gpx4蛋白表达

冻存的肺组织经RIPA裂解，12 000 r/min离心30 min后提取总蛋白样品30µg，上样在12%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，分离蛋白后转移至醋酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入待检蛋白山羊抗大鼠一抗Nrf2(1∶2 000）、Gpx4(1∶2 000）、GAP⁃DH(1∶2 000) 4℃孵育过夜，经TBST溶液清洗后加入二抗孵育2 h。ECL化学发光液显影，Image J分析条带灰度值。

1.2.8 透射电镜下脑组织的超微结构

将肺组织置于预冷的3%戊二醛溶液中固定，4℃下保存24 h后取出，PBS冲洗3次，1%四氧化锇酸固定2 h，再次漂洗，经过逐级乙醇脱水后用环氧树脂包埋、切片、载网，用4%醋酸双氧铀和0.4%柠檬酸铅双重染色，在透射电镜下观察细胞超微结构，采集图像。

1.3 统计学处理

采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示。W/D、损伤评分采用非参数（Mean-Whitney)U检验。多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 肺损伤评分与肺组织W/D测定

HE染色光镜下可见，Sham组肺泡结构清晰，肺泡及肺间质无水肿，几乎未见炎症细胞浸润；与Sham组比较，Sep⁃sis组肺泡及肺泡间质充血、水肿，肺泡内透明膜形成，可见大量炎症细胞浸润以及点状或片状出血灶；Cur组较Sepsis组损伤明显减轻，肺间质水肿减轻，炎症细胞浸润减少、肺泡及组织结构大部分清晰（图1）。Cur组肺损伤评分、W/D均低于Sepsis组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 肺组织中MDA、GSH、Fe2+含量的影响

与Sham组比较，Sepsis组中肺组织MDA、Fe2+含量升高，GSH含量降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与Sepsis组比较，Cur组中MDA、Fe2+含量降低，GSH含量升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3 肺组织中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影响

与Sham组比较，Sepsis组中肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β含量升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与Sepsis组比较，Cur组中TNF-α、IL-6、IL-1β含量降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.4 肺泡上皮细胞凋亡分析

经TUNEL检测发现，Sham组可见肺泡上皮细胞呈淡蓝色，形态清晰、完整；Sepsis组见大量肺泡上皮细胞及血管内皮细胞凋亡（呈棕色或棕黄色颗粒），AI为（43.5±4.7）%；而Cur组较Sepsis组凋亡细胞明显减少，Cur组AI为（26.8±3.8）%，低于Sepsis组，高于Sham组（3.6±1.3）%，差异有统计学意义（P<0.05），如图2。

图1 肺组织病理学分析（×200)

表1 各组大鼠肺组织W/D与肺损伤评分测定

表2 各组大鼠肺组织中MDA、GSH、Fe2+的含量

表3 Cur对脓毒症大鼠肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影响

图2 TUNEL检测肺泡细胞凋亡与AI分析（×200)

图3 肺组织中Gpx4与Nrf2蛋白水平表达情况

图4 各组肺组织超微结构变化（×10 000)

2.5 肺组织中Nrf2、Gpx4蛋白水平表达

Western blot检测发现，在Cur组中Gpx4蛋白表达水平为（51.2±5.3）%，低于Sham组（85.4±4.6）%，高于Sepsis组（34.6±4.2）%，差异有统计学意义（P<0.05);Cur组中Nrf2蛋白表达水平为（158.2±12.2）%，低于Sham组（185.3±14.9）%，高于Sepsis组（116.4±10.4）%，差异有统计学意义（P<0.05），如图3。

2.6 透射电镜下肺组织超微结构情况

透射电镜下可见，Sham组肺泡上皮细胞核膜完整，核染色质分布均匀，线粒体结构清晰、轮廓完整；而Sepsis组细胞线粒体皱缩、双层膜结构增厚、嵴断裂或产生空化现象；Cur组仅见线粒体轻度水肿，嵴减少或部分断裂、形态基本完整。如图4。

3、讨论

脓毒症是机体对感染反应失调导致危及生命的器官功能障碍，其中肺脏是临床常见的受累器官。脓毒症急性肺损伤的机制十分复杂，涉及细胞炎症因子、凝血/纤溶系统、水通道蛋白、细胞凋亡、焦亡和自噬等。近年来，铁死亡在疾病中的诊疗价值备受关注，如缺血再灌注损伤、急性脑卒中、脑外伤、肿瘤疾病、感染性疾病、退行性疾病等。铁死亡的主要机制是在Fe2+或脂氧合酶作用下细胞膜上多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化引起细胞内MDA水平升高，诱发铁死亡发生。MDA是机体内氧自由基代谢产生的脂质过氧化产物，可间接反映组织中活性氧水平。GSH是细胞内重要的抗氧化剂和氧自由基清除剂，与Gpx4反应发挥氧化还原作用，保护细胞内蛋白质、DNA、脂质等生物大分子。姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种天然化合物，具有抑制炎症反应、清除氧自由基等作用，对感染继发脏器损伤发挥保护效应[11-14]。本实验通过大鼠CLP建立脓毒症模型探讨姜黄素与脓毒症ALI的关系及铁死亡机制，姜黄素剂量采用200 mg/kg，是安全、有效的剂量[15]。研究表明，姜黄素干预后组织中MDA含量减少，GSH含量升高，提示姜黄素通过下调脂质过氧化物蓄积抑制铁死亡的发生。

既往研究表明，脓毒症发病过程中ALI与大量炎症细胞浸润以及局部组织中细胞凋亡有关[16-18]。本研究中，Sepsis组炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β分泌增多，HE染色可见大量炎症细胞浸润、组织水肿，肺泡及肺间质充血，肺泡内透明膜形成，肺脏出现血栓及肺不张。电镜下可见线粒体萎缩、嵴减少或断裂、线粒体膜破坏等铁死亡特有的征象。姜黄素干预后炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达下调，低于Sepsis组；病理学检查可见肺组织水肿减轻、炎症细胞浸润减少，肺泡及组织结构大致清晰，在电镜结果中也得到证实。TUNEL检测姜黄素组Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡率下降，这些结果充分说明姜黄素通过下调炎症因子与抑制细胞凋亡对脓毒症大鼠急性肺损伤起保护作用。

Gpx4是一种硒依赖型抗氧化酶，主要功能是清除过量活性氧保护DNA，抑制脂质过氧化的发生，对铁死亡具有负性调控作用[19-21]。当Gpx4反应受限时，Fe2+出现超载引发脂质过氧化发生，导致细胞铁死亡。Nrf2是Gpx4的上游基因，是维持氧化/抗氧化的关键调节蛋白，对细胞内Fe2+有调控作用，也可靶向调节Gpx4表达，而Gpx4可利用GSH干扰脂质过氧化反应，胞内GSH大量消耗后GPX4活性降低，导致脂质过氧化物蓄积，Fe2+以芬顿反应的方式氧化脂质，产生大量活性氧，诱导铁死亡的发生[22]。本研究发现，Cur组Gpx4蛋白表达高于Sepsis组，Nrf2蛋白表达低于Sepsis组，Fe2+、MDA含量低于Sepsis组，说明姜黄素通过激活Nrf2蛋白表达上调Gpx4与GSH含量，抑制铁超载和脂质过氧化作用。

本研究结果表明，铁死亡是脓毒症ALI的一种潜在机制，姜黄素通过抑制炎症因子释放与GSH/Gpx4介导的铁死亡减轻脓毒症引起的ALI，为临床治疗脓毒症ALI提供新思路。然而，本研究也存在一定的局限性，缺少炎症因子与铁死亡、Nrf2/Gpx4上游信号通路的探讨，在今后的工作中有待进一步研究。

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基金资助:辽宁省医学教育研究项目(2022-N004-12); 辽宁省自然科学基金项目(2019-ZD-0644);

文章来源:王磊,蒯鑫,李青松,等.姜黄素抑制Gpx4介导的铁死亡减轻大鼠脓毒症急性肺损伤[J].中国免疫学杂志,2024,40(10):2116-2120.