脓毒症是一种由感染引起的全身性炎症反应综合征，可能导致脑、心、肝、肾等多器官功能障碍，具有高发病率和高死亡率的特点。脓毒症早期常伴随大脑功能障碍[1]，出现意识模糊、昏迷等症状[2]，称为脓毒症相关脑病（sepsis-associated encephalopathy,SAE）。SAE的发生导致病情进一步恶化，严重影响患者预后和生活质量，甚至增加死亡风险[3]。既往研究显示SAE发病机制复杂[4]，而过度的炎症反应和氧化应激在其发生和发展中均起关键作用[5]，最终导致细胞凋亡。研究显示胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1）作为一种肠内分泌激素，不仅能调节血糖平衡和能量稳态[6]，还具备抗炎、抗氧化和神经保护等作用[7]，可能为SAE的治疗提供新思路。

利拉鲁肽属长效GLP-1类似物，它不仅广泛应用于2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）的治疗，还对脑出血、创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）、阿尔茨海默氏病（Alzheimer's disease,AD）等多种神经系统疾病具有保护作用[8]。这些神经系统疾病的共同病理特征是过度的炎症反应、氧化应激和细胞凋亡，与SAE的病理机制相似。同时NEVES等[9]通过对小鼠皮下注射利拉鲁肽，发现其认知功能障碍得到明显改善。因此，推测利拉鲁肽可能在SAE中发挥保护作用，但其机制仍不明确，尚需进一步开展相关研究。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎性小体是由NLRP3、衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC）和半胱天冬酶前体-1(procaspase-1）组成的多蛋白复合物。研究表明，NLRP3炎性小体可激活caspase-1表达，促进炎性细胞因子前体白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β）和白介素-18(interleukin-18,IL-18）的成熟和分泌[10]；同时，调控caspase-1依赖性的炎性细胞死亡，导致细胞在炎性和应激条件下死亡[11]。抑制NLRP3炎性小体可保护AD、TBI、缺氧缺血性脑损伤和蛛网膜下腔出血等神经系统疾病。有研究提示，NLRP3在SAE的病理生理过程中发挥有害作用，促进炎症反应和神经细胞凋亡[12]。此外，在脂多糖（lipolyaccharide,LPS）诱导的急性肺损伤和非酒精性脂肪肝中，利拉鲁肽可下调NLRP3炎性小体的表达，减少炎性损伤[13-14]。

因此，本研究旨在评估利拉鲁肽对SAE的保护作用，并探讨其是否通过抑制NLRP3炎性小体信号通路，发挥抗炎、抗氧化应激及抗凋亡作用。

1、材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠（8～12周），购自成都达硕实验动物有限公司（许可证编号：SYXK川2018-065），在标准环境下饲养。本研究经西南医科大学伦理委员会批准（批号：20211122-012）。

1.1.2模型制备

将90只小鼠按随机数字表法分为3组，每组30只。对照组（Control）：腹腔注射生理盐水；脓毒症组（LPS）：腹腔注射LPS(15 mg/kg）；脓毒症+利拉鲁肽组（LPS+Lira）：在LPS注射前2天开始皮下注射利拉鲁肽（200μg/kg），每日2次，连续3 d，随后腹腔注射LPS(15 mg/kg）。脓毒症小鼠建模成功标准：小鼠表现出精神萎靡、呼吸急促及活动减少的症状。

1.1.3实验试剂

细胞凋亡检测采用TUNEL试剂盒（罗式，瑞士）。免疫荧光染色及Western blot采用NLRP3抗体（Novus Biologicals，美国），Casp1 p10抗体（Santa Cruz，美国），caspase 3和Beta action抗体（武汉三鹰，中国），Bax抗体（Cell Signaling，美国），Bcl-2抗体（Abcam，美国）。炎症因子检测采用ELISA试剂盒（碧云天，中国）。

1.1.4灌注和取材

LPS注射24 h后，小鼠经戊巴比妥钠麻醉并摘眼球取血，离心后冻存血清。取血后，用生理盐水灌注小鼠。取大脑后擦干血渍称重，用于检测脑含水量；右侧半脑石蜡包埋用于HE染色；左侧半脑切冰冻切片用于免疫荧光剂TUNEL染色；海马组织冻存于-80℃，用于Western blot和ELISA分析。

1.2检测指标与方法

1.2.1生存率

记录每组12只小鼠建模后7 d的生存情况，计算7 d生存率。生存率=生存到7 d的小鼠数/12×100%。

1.2.2海马组织病理改变

LPS注射24 h后，小鼠被处死，经主动脉灌注生理盐水和10%福尔马林。取出大脑固定于10%福尔马林，脱水、包埋、切片，进行HE染色。在200倍显微镜下观察海马组织病理变化。

1.2.3脑含水量

采用干-湿重法测定脑含水量：造模24 h后麻醉取脑，称重并记录湿重，65℃烘烤48 h至恒定后记录干重。计算公式：脑含水量=[(湿重-干重）/湿重]×100%。

1.2.4细胞凋亡率

左侧半脑切片（厚度8μm），用4%多聚甲醛固定30 min,0.2%Triton X-100通透15 min。TUNEL反应液在37℃避光孵育1 h,PBS清洗后，DAPI染色细胞核5 min。在200倍荧光显微镜下观察海马CA1区，统计TUNEL阳性细胞数和总细胞数，计算细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.5海马组织蛋白表达

采用Western blot法检测小鼠海马组织中的NLRP3,Casp1 p10,Caspase-3,Bax和Bcl-2蛋白表达情况。海马组织样本在RIPA裂解液中匀浆后，用Enhanced BCA Protein Assay Kit定量蛋白。蛋白样本变性后进行SDS-PAGE电泳并转膜，5%脱脂奶封闭1 h,4℃下与NLRP3、Casp1 p10、caspase 3、Bax、Bcl-2、Beta action抗体孵育过夜。TBST洗涤后，二抗室温孵育1 h。使用化学发光成像系统捕获蛋白印迹，并用Image J软件定量分析，将对照组蛋白表达水平标准化为1。

1.2.6免疫荧光染色

冰冻切片固定和通透后，BSA封闭1 h,4°C下与NLRP3和cleaved-caspase-1抗体孵育过夜。PBS洗涤后，与FITC标记的二抗室温孵育1 h。DAPI染色细胞核5 min，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下拍摄图像并用Image J分析荧光强度。

1.2.7氧化应激

使用SOD试剂盒和MDA试剂盒，分别测定血清与海马组织中的SOD活性及MDA含量，按照试剂盒说明书操作。

1.2.8炎性因子

采用ELISA试剂盒检测海马及血清中的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α），白介素6(interleukin-6,IL-6）、IL-1β、IL-18。

1.3统计学分析

所有数据使用SPSS 23.0软件分析。用Kaplan–Meier法分析小鼠生存率，组间差异采用Log-rank test进行比较；计量资料使用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比较采用LSD检验法。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1生存率

Control组7 d生存率为100%,LPS组7 d生存率为16.7%,LPS+Lira组7 d生存率为50%,3组间小鼠生存率差异具有统计学意义（χ²=18.95,P<0.01）。进一步两两比较显示，LPS组与Control组，LPS+Lira组与LPS组间的差异均有统计学意义（P<0.05，图1A）。

2.2脑含水量

Control组小鼠脑含水量为（76.45±0.87)%,LPS组脑含水量为（78.53±0.70)%,LPS+Lira组脑含水量为（76.88±0.83)%,3组间小鼠脑含水量差异具有统计学意义（F=11.21,P<0.01）。进一步两两比较显示，LPS组与Control组，LPS+Lira组与LPS组间的差异均具有统计学意义（P<0.01，图1B）。

2.3海马组织病理变化

3组小鼠海马CA1区每平方毫米的正常锥体细胞数间差异具有统计学意义（F=13.41,P<0.05）。Control组小鼠海马CA1区细胞排列整齐，分布均匀，结构完整，正常锥体细胞数为（508.2±65.5）个；LPS组细胞排列紊乱，形态不规则，出现细胞丢失、溶解、胞浆深染、胞核固缩等病变，正常细胞数量为（203.7±122.5）个；LPS+Lira组小鼠的病理变化较LPS组有所恢复，正常细胞数为（390.5±111.1）个（图1C、图1D）。

2.4细胞凋亡率

Control组小鼠海马细胞凋亡率为（1.18±0.74)%,LPS组细胞凋亡率为（15.52±4.99)%,LPS+Lira组细胞凋亡率为（6.38±3.84)%,3组小鼠细胞凋亡率比较差异具有统计学意义（F=23.57,P<0.05）；进一步两两分析显示，LPS组与Control组，LPS+Lira组与LPS组间的细胞凋亡率差异均具有统计学意义（P<0.05，图1E、图1F）。

图1利拉鲁肽对LPS小鼠7天存活率（n=12），脑含水量，海马病理改变（n=6，×200）及细胞凋亡（n=6，×200）的影响

3组相关蛋白表达水平间差异均具有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较显示，与Control组相比，LPS组NLRP3、Casp1 p10、Caspase-3、Bax蛋白表达水平均显著上调（P<0.01，图2A-图2E），而Bcl-2蛋白表达水平降低（P<0.05，图2A、图2F）。LPS+Lira组与Control组相比，NLRP3、Casp1 p10、Caspase-3、Bax蛋白表达间差异均无统计学意义（P>0.05）。与LPS组相比，LPS+Lira组NLRP3、Casp1 p10、Caspase-3、Bax蛋白表达水平均下调，Bcl-2蛋白表达水平上调（P<0.05，图2A-图2F）。

2.6免疫荧光染色结果

免疫荧光结果见图3A、图3C。定量分析结果显示，与Control组相比，LPS组与LPS+Lira组小鼠海马组织中NLRP3以及Casp1 p10的表达均显著增加（P<0.05，图3B、图3D）。与LPS组相比，LPS+Lira组中NLRP3和Casp1 p10的表达均降低（P<0.01，图3B、图3D）。

图2各组小鼠NLRP3,Casp1 p10,Caspase-3,Bax和Bcl-2蛋白表达情况（n=6)

图3各组小鼠海马组织NLRP3/Casp1 p10荧光染色结果（n=6，×200)

2.7氧化应激

与Control组相比，LPS组海马及血清中SOD活性降低（P<0.01，图4A、图4C）而MDA含量增高（P<0.01，图4B、图4D）；与LPS组相比，LPS+Lira组中SOD活性增加(P<0.05，图4A、图4C）而MDA含量下降（P<0.01，图4B、图4D）。

图4各组小鼠SOD和MDA表达情况（n=6)

2.8炎症因子

与Control组比较，LPS组和LPS+Lira组小鼠的血清及海马中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18的含量均升高(P<0.05，图5）；与LPS组比较，LPS+Lira组中的IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18的含量均下调(P<0.05，图5）。

图5各组小鼠炎症因子表达情况（n=6)

3、讨论

本研究发现，利拉鲁肽显著提高了脓毒症小鼠的生存率，改善了海马组织病理损伤，抑制了细胞凋亡，减轻了脑水肿。表明利拉鲁肽对LPS诱导的脓毒症脑损伤具有保护作用。

脓毒症是一种全身性炎症反应，炎症介质可以直接或间接进入脑实质，诱发氧化应激、线粒体功能障碍和小胶质细胞活化，导致神经病理异常。TNF-α和IL-6是脓毒症中的主要炎症因子，能够加重炎症，增加脑水肿，并促进神经元凋亡[15-17]。本研究显示，LPS处理后海马和血清中这些炎症因子显著增高，而利拉鲁肽能减少炎症因子的表达，表明其能抑制LPS诱导的炎症反应。此外，氧化应激是引起脓毒症脑损伤的重要因素[18]。利拉鲁肽通过减少海马和血清中MDA表达，提高了SOD活性，展现了减轻氧化应激的脑保护作用。利拉鲁肽还降低了促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的水平，提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，进一步表明其能通过抑制细胞凋亡保护脑组织[19-20]。

NLRP3是NLRs家族中的重要成员，被激活后可形成NLRP3炎性小体复合物(NLRP3,ASC,pro-caspase-1），最终激活caspase-1，促使炎症因子pro-IL-1β及pro-IL-18裂解与分泌[9]。NLRP3炎性小体参与了多种神经炎症性疾病的发生发展。ISMAEL等发现，NLRP3抑制剂MCC950可有效减轻TBI后的脑水肿，抑制炎症因子IL-1β与TNF-α的表达，并显著抑制Caspase-3和cleaved PARP的表达，通过抗炎和抗凋亡途径减轻TBI损伤[21]。ZHU等[22]发现，NLRP3炎性体抑制剂AcYVAD-CMK可改善LPS诱导的长期抑郁样行为和记忆力减退。LPS通过Toll样受体4介导激活NLRP3通路，诱发IL-1β的表达[23]。在本研究中，LPS注射后海马中NLRP3以及cleaved caspase-1的表达显著增加，表明NLRP3炎性体参与了脓毒症脑损伤的进展。利拉鲁肽表现出抗炎和抗氧化应激的作用，在LPS诱导的急性肺损伤模型中，利拉鲁肽也可抑制NLRP3炎性小体的高表达[24]。在本研究中，利拉鲁肽处理抑制了脓毒症小鼠海马中NLRP3以及caspase-1 p10的表达。ELISA结果显示，利拉鲁肽还抑制了LPS引起的IL-1β与IL-18的表达增加，进一步证明了其对NLRP3/Caspase-1通路的抑制作用。

此外，LPS诱导的Caspase-3在海马中的表达增加，而利拉鲁肽抑制了Caspase-3的表达，这可能与其抑制NLRP3炎性小体产生的作用有关。NLRP3炎性小体还可通过ASC寡聚化激活caspase-1，诱发细胞焦亡[25]。利拉鲁肽的脑保护作用可能也与抑制NLRP3炎性体进而抑制细胞焦亡有关。

4、结论

利拉鲁肽通过抑制NLRP3/Caspase-1信号通路激活，减轻炎症反应、氧化应激及细胞凋亡，从而对脓毒症小鼠脑损伤产生保护作用，这一研究结果可能为利拉鲁肽的临床应用提供新的理论依据。

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基金资助:国家自然科学基金(81873930);四川省科技计划项目(2022YFS0615);泸州市科技计划项目(2023SYF099);

文章来源:郭焰,杨程杰,母国,等.利拉鲁肽通过抑制NLRP3炎症小体信号通路改善脓毒症小鼠脑损伤[J].西南医科大学学报,2025,48(01):41-46.