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水蛭素对脓毒症大鼠凝血功能障碍影响的实验研究

2024-03-01 14 上传者：管理员

摘要：目的探讨水蛭素对脓毒症大鼠凝血功能障碍的影响。方法将75只大鼠随机分为假手术组、模型组和水蛭素组。除假手术组外，其余各组以盲肠结扎穿孔的方法建立脓毒症大鼠模型。术后取大鼠静脉血样本，检测各组及各时间点的常规凝血功能指标和凝血与血小板功能分析仪参数，取大鼠肺和回肠组织进行病理切片观察，采用方差分析各组的凝血指标，并观察各组大鼠48h的生存率。结果术后48h,假手术组、模型组和水蛭素组大鼠的存活率分别为100%、10%和50%。术后6h:水蛭素组大鼠的血小板计数较模型组显著降低；模型组大鼠的活化凝血时间(activated clotting time, ACT)较假手术组、水蛭素组明显缩短(F=7.190,P<0.05);模型组、水蛭素组大鼠的凝血速率(clot rate, CR)值较假手术组显著上升(F=4.549,P<0.05)。术后12h:模型组和水蛭素组大鼠的血小板计数较假手术组明显降低(F=4.780,P<0.05);模型组大鼠的ACT值和CR值明显延长(F=4.863、12.923,P<0.05);水蛭素组大鼠的CR值上升；模型组、水蛭素组大鼠的CR值较假手术组显著上升(F=11.791,P<0.05)。术后24h:模型组大鼠的ACT值和CR值明显延长(F=4.863、12.923,P<0.05);水蛭素组大鼠的血小板计数较模型组显著升高(F=13.574,P<0.05);模型组、水蛭素组大鼠的CR值较假手术组显著上升，而水蛭素组大鼠的CR值较模型组明显下降(F=25.854,P<0.05)。水蛭素组大鼠肺泡腔减少数量、炎症细胞浸润及微血管内微血栓形成较模型组大鼠明显减轻；肠粘膜上皮坏死、间质水肿及炎症细胞浸润情况较模型组大鼠显著减轻。结论水蛭素能上调大鼠的血小板数量，调节凝血因子活性和纤维蛋白原功能，保护脓毒症大鼠的肺肠器官功能，降低其死亡率。

关键词：
凝血与血小板功能分析仪
凝血功能
器官功能障碍
水蛭素
脓毒症
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脓毒症被认为是机体对感染的反应失调所导致的危及生命的器官功能障碍，甚至可能进展为脓毒性休克或弥散性血管内凝血。全球脓毒症的年患病人数逐年增加，其中美国每年约有170万脓毒症患者，因脓毒症死亡的患者高达26.5万人[1]。国内一项多中心流行病学调查表明，脓毒症在ICU的发病率高达20.6%,病死率为35.5%[2]。凝血功能障碍脓毒症作为脓毒症的常见并发症，是决定脓毒症不良预后的关键因素[3,4]。据报道，脓毒症患者一旦发生凝血功能障碍，其死亡率更高[5]。

水蛭素为中药水蛭的主要成分，其是由一条含65或66个氨基酸残基所组成的分子质量为7KD的单链多肽。现代研究表明，水蛭素的生物活性主要包括抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化及抗纤维化[6,7]。凝血与血小板功能分析仪是一种床旁凝血功能检测仪器，其具有快速、准确监测凝血全过程的特点[8]。已有相关文献报道凝血与血小板功能分析仪用于监测脓毒症患者的凝血功能变化[9,10]。本研究旨在探讨水蛭素对脓毒症大鼠凝血功能障碍的影响及其可能机制。

1、材料与方法

1.1实验动物、主要仪器与试剂

收集75只2月龄的SD大鼠[购于长沙市天勤生物技术有限公司，SCXK(湘2019-0014)],体质量(221.4±6.1)g。大鼠在适宜的环境温度(19～23℃)及空气湿度(50%～60%)中被适应性饲养至少3d,动物均自由饮水饮食。凝血与血小板分析仪(型号：YKCA-2,世纪亿康医疗科技发展有限责任公司)及配套试剂；ACL-TOP700全自动血凝分析仪(美国沃芬公司，TOP700)及配套试剂；水蛭素(购自上海源叶生物科技有限公司，生产批号：s31625)溶液配置：取1ml重组水蛭素浓缩液(10mg/ml)溶于9ml的0.9%氯化钠注射液，充分摇匀配制成1mg/ml的原液，置于4℃避光保存备用，使用时用0.9%氯化钠注射液稀释成所需浓度即可。10%水合氯醛(中国人民解放军第一七五医院生产)。本研究符合医学伦理学标准，并获医院伦理委员会批准(伦理号：LC20222012)。

1.2盲肠结扎模型

除假手术组以外，其余组用盲肠结扎穿孔法建立脓毒症大鼠模型[11]。模型制备：术前禁食12h,大鼠经10%水合氯醛麻醉后，消毒腹部，在腹中线切开约1.0cm长切口。探查到盲肠后，在距离其回盲部1/2处结扎盲肠，用20G无菌针头穿通3次并轻挤压盲肠直至少量(0.3ml)内容物被挤出，还纳盲肠于腹腔并逐层缝合腹部切口以关腹。

1.3实验分组

将75只大鼠随机分为假手术组、模型组和水蛭素组。各组均随机抽取10只大鼠用于观察48h生存情况。假手术组大鼠术后腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液，1次/d,按时间点处死并取其静脉血标本及病理组织；模型组大鼠术后腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液，1次/d,按时间点处死并取其静脉血标本及病理组织；水蛭素组大鼠在盲肠结扎术后腹腔注射水蛭素[mg/(kg·d)],按时间点处死并取其静脉血标本及病理组织。

1.4常规凝血项目检测

采用含枸橼酸抗凝液的试管从静脉采血2ml,以每分钟3 000r的转速在离心半径为13.5cm的离心机中离心10min,收集上层血浆，在全自动凝血分析仪上分别检测活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time, APTT)、纤维蛋白原(fibrinogen, FIB)、D-二聚体(D-dimer)和抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ,AT3)。

1.5凝血与血小板功能分析仪检测

依据仪器操作说明书完成凝血与血小板功能检测并记录激活全血凝固时间(activated clotting time of whole blood, ACT)、血小板因子(platelet facto, PF)和CR值。ACT反映凝血因子相互作用；CR值反映纤维蛋白原形成速率；PF反映血小板功能。

1.6 HE染色观察大鼠肺及回肠组织病理形态表现

将大鼠的肺、回肠组织切片苏木精-伊红染色观察病理损伤改变。

1.7统计学分析

应用生存分析Kaplan-Meier法比较各组大鼠生存率的差异；经单样本(Kolmogorov-Smirnov, K-S)检验法正态性检验符合正态分布的数据，采用单因素方差分析最小显著性差异(least significant difference, LSD)法进行多组间比较(F检验)。符合偏态分布的数据使用秩和检验进行多组间比较。正态分布的数据用均数±标准差表示，符合偏态分布的数据以中位数(四分位数间距)表示。数据分析使用SPSS 25.0统计学软件，以P<0.05为差异有统计学意义。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1生存率分析

术后48h,假手术组大鼠均存活，生存率为100%;模型组的大鼠存活1只，生存率为10%;水蛭素组大鼠存活5只，生存率为50%。水蛭素组的大鼠48h生存率高于模型组(χ2=16.97,P<0.05),表明水蛭素能降低脓毒症大鼠48h的病死率。见图1。

图1模型组和水蛭素组大鼠术后48h生存率比较

2.2常规凝血功能项目比较

模型组大鼠的APTT术后24h较术后6h明显升高(F=4.968,P<0.05),FIB术后24h较术后6h、12h均显著升高(F=13.384,P<0.05),但PLT术后24h较术后6h、12h均显著降低(F=12.414,P<0.05)。水蛭素组大鼠的APTT术后24h较术后6h明显升高(F=4.696,P<0.05),FIB术后24h较术后6h、12h均显著升高(F=4.432,P<0.05)。模型组和水蛭素组大鼠的FIB在术后12h和24h,较假手术组显著升高(F=11.702,F=15.931,P<0.05);模型组大鼠的AT3在术后12h较假手术组显著降低(F=4.179,P<0.05);与假手术组相比，模型组大鼠的PLT在术后24h明显下降(F=13.574,P<0.05),而水蛭素组大鼠的PLT在术后12h、24h均明显下降(F=4.780,F=13.574,P<0.05);与模型组相比，水蛭素组大鼠的PLT在术后6h显著降低(F=4.258,P<0.05),于24h显著升高(F=13.574,P<0.05);与模型组相比，水蛭素组大鼠的AT3在术后12h显著升高(F=5.032,P<0.05),表明脓毒症时血小板消耗性减少，凝血因子消耗表现为部分凝血酶原时间延长，水蛭素能上调血小板计数。见表1。

表1术后不同时间各组大鼠常规凝血项目的比较(n=5)

2.3各组凝血与血小板功能分析仪测试参数

模型组中，PF值各时间点差异均无统计学意义(F=0.017,均P>0.05);ACT值及CR值在术后12h、24h明显延长(F=4.863、12.923,P<0.05)。水蛭素组中，ACT、PF值各时间点差异无统计学意义(F=3.467、0.312,P>0.05);CR值在术后12h延长，于24h明显缩短(F=7.927,P<0.05);模型组大鼠的ACT值在术后6h较假手术组明显缩短(F=7.190,P<0.05);水蛭素组大鼠的ACT值在术后6h较模型组显著延长(F=7.190,P<0.05);与假手术组相比，模型组及水蛭素组大鼠的CR值在6、12和24h明显上升(F=4.549、11.791、25.854,P<0.05);与模型组相比，水蛭素组大鼠的CR值在术后24h明显下降(F=25.854,P<0.05),表明水蛭素能够调节凝血因子功能及纤维蛋白原功能。见表2。

2.4各组大鼠回肠组织病理形态表现

假手术组大鼠回肠组织结构正常，肠粘膜清晰，肠绒毛完整，腺体排列有规律，无炎症细胞浸润。与假手术组相比，模型组大鼠术后6、12、24h均可见毛细血管充血，固有层可见散在的淋巴细胞浸润，部分肠绒毛结构消失，肠绒毛顶端粘膜上皮坏死脱落。与模型组相比，水蛭素组大鼠术后6、12、24h的肠粘膜疏松、肠绒毛顶端粘膜上皮坏死脱落、间质水肿及炎症细胞浸润情况明显减轻，表明水蛭素具有抗炎及保护肠组织的作用。见图2。

2.5各组大鼠肺组织病理形态表现

假手术组大鼠肺泡结构完整，上皮细胞形态正常，泡腔及间质无渗出、出血及炎性细胞浸润。与假手术组相比，模型组大鼠术后6h、12h、24h均可见肺泡间隔宽度增加或结构破坏，间质充血及水肿，大量的炎症细胞浸润。与模型组相比，水蛭素组大鼠术后6h、12h和24h均可见肺间质充血及水肿、微血管微血栓及炎症细胞浸润程度明显减轻，表明水蛭素具有抗炎、抗血栓及保护肺组织的作用。见图3。

表2术后不同时间各组大鼠的凝血项目与血小板功能分析仪参数比较(n=5)

图2光学显微镜下各组大鼠的回肠组织照片

图3光学显微镜下各组大鼠肺脏组织照片

3、讨论

脓毒症具有高发病率及高死亡率的特点，是目前国际医学领域所面临的重要难题[12]。近年随着对脓毒症发病机制研究的不断深入，以及对中医药治疗脓毒症的分子机制及具体作用靶点的不断探索和发掘，使中医药治疗脓毒症成为目前研究的热点。多靶点、多途径发挥对疾病的治疗作用是中药的独特优势，对发病机制极其复杂的脓毒症更有优势。水蛭素为特异性凝血酶抑制剂，具有较强的抗凝血和抗血栓作用，还能抑制炎性细胞的增殖，并通过下调核转录因子-кB(nuclear factor-kappa BNF-кB)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达，抑制炎症的发生[13,14,15]。但水蛭素对脓毒症时机体凝血功能的作用目前尚无相关报道。

本研究结果显示，模型组大鼠术后的血小板计数明显下降，水蛭素可通过上调模型组大鼠术后24h的血小板计数，改善纤维蛋白原及凝血因子的功能，减轻肺及肠组织损伤，降低脓毒症48h病死率。其具体机制目前尚不清楚，可能与水蛭素的抗炎、调节凝血功能状态方面密切相关。

APTT主要反映内源性凝血因子活性。凝血与血小板分析仪能提供凝血过程的全部信息，包括凝血因子功能、纤维蛋白原形成速率及血小板功能[16,17]。本研究显示，假手术组大鼠术后24h的APTT较模型组与水蛭素组明显缩短，说明脓毒症时大鼠内源性凝血因子活性明显减弱。凝血与血小板分析仪检测结果显示术后6h,模型组大鼠的ACT较假手术组显著缩短(F=7.190,P<0.05),病理切片结果也显示盲肠结扎穿孔术(cecum ligation and puncture, CLP)术后6h肺部微血管形成微血栓，说明脓毒症早期大鼠凝血因子功能明显增强，促进微血栓形成；水蛭素组大鼠的ACT在术后6h较模型组明显延长(F=7.190,P<0.05),病理切片结果显示水蛭素组大鼠术后6h的肺部微血管形成微血栓减轻，表明水蛭素能减弱脓毒症早期大鼠的凝血因子功能，避免脓毒症早期大量微血栓形成。同时提示常规凝血功能检测可能对脓毒症早期大鼠凝血因子活性变化不敏感[18]。

纤维蛋白原作为一种急性时相反应蛋白，在脓毒症进展至晚期之前可能一直处于假性正常甚至更高水平，其机制可能是脓毒症时血浆中纤溶酶原激活物抑制剂-1水平持续升高，纤溶活性被抑制，大量纤维蛋白不能及时有效降解，导致血浆中纤维蛋白原假性增加[19,20,21]。因此，FIB对脓毒性凝血病的病理学特征的反映敏感性较低。CR反映纤维蛋白形成的速率，间接反映FIB的水平及功能，较FIB监测更准确。本研究显示，术后12h、24h模型组及水蛭素组大鼠的FIB较假手术组升高(F=11.702、15.931,P<0.05),而模型组和水蛭素组大鼠的CR值在6、12、24h均明显上升(F=4.549、11.791、25.854,P<0.05),说明随着脓毒症的发展，大鼠纤维蛋白的形成速率增强，急性时相反应蛋白——纤维蛋白原亦增加，但CR值较FIB对脓毒症时纤维蛋白原的变化更敏感。此外，术后12h水蛭素组大鼠的CR值较模型组上升，而在术后24h较模型组明显下降(F=25.854,P<0.05),说明水蛭素能调节脓毒症大鼠的纤维蛋白原数量和功能。此外，水蛭素组大鼠术后6、12和24h的肠绒毛顶端粘膜上皮坏死脱落、间质水肿及炎症细胞浸润程度均较模型组大鼠减轻，且肺间质充血、水肿及炎症细胞浸润程度较模型组大鼠也减轻，提示水蛭素对脓毒症大鼠的肺和肠组织可能具有一定的保护作用。

综上所述，盲肠结扎模型中，脓毒症大鼠的凝血状态表现为凝血因子功能先增强后减弱，纤维蛋白原数量增加及功能增强。水蛭素能上调大鼠的血小板数量，调节凝血因子及纤维蛋白原功能，保护肺肠器官功能，降低脓毒症死亡率。

利益冲突无

参考文献:

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基金资助:江西省卫生计生委科技计划(202211652);

文章来源:张念清,曾庆波,王芳等.水蛭素对脓毒症大鼠凝血功能障碍影响的实验研究[J].医学动物防制,2024,40(04):388-392+398.