脓毒症是一种全身性炎症反应综合征，由病原菌、病毒或真菌感染引发[1]。急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是最常见的脓毒症严重并发症之一，是一种严重急性呼吸衰竭综合征[2]。目前ALI的治疗以抗生素和支持疗法为主，疗效十分有限[3]。因此，探索脓毒症引起ALI的发病机制，寻找新的治疗药物是亟待解决的问题。槲皮素（quercetin,QUE）是一种天然类黄酮，存在于许多蔬菜和水果中，具有广泛的生理活性，如抗炎、抗氧化、清除自由基、细胞保护和抗过敏活性，特别是由于其调节炎症和氧化还原失衡能力，已被作为肺部疾病的治疗选择[3,4,5,6]。本研究通过盲肠结扎和穿刺（cecum ligation and perforation,CLP）方法建立大鼠脓毒症肺损伤模型，以探究QUE对ALI的保护作用及机制。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

SPF级雄性健康SD大鼠120只，6～8周龄，体质量（220±20) g，由川北医学院提供，生产许可证号：SCXK（川）2018-18，饲养于该实验动物中心[SYXK（川）2018-076]。动物实验获得川北医学院动物伦理委员会批准（IACUC-20200417-08），实验过程遵循3R原则。大鼠在温度（24±2）℃，湿度50%，光照为12h/12h光/暗环境下适应性喂养1周。

1.1.2主要试剂及仪器

槲皮素（HPLC≥98%，上海源叶公司）；地塞米松（dexamethasone,DEX，天津金耀药业有限公司）；TUNEL凋亡检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL发光液和RIPA裂解缓冲液（碧云天生物公司）；兔抗大鼠活化胱天蛋白酶3(cleaved cas3）单克隆抗体（#9664）、兔抗大鼠活化胱天蛋白酶9(cleaved cas9）多克隆抗体（#9507）（美国CST公司）；兔抗大鼠Bax(ab32503）、p-PTEN(ab109454）、PTEN(ab267787）、p-β-catenin(ab75777）、-catenin(ab68183）、糖原合酶激酶-3β(glycogenβsynthase kinase-3β,GSK-3β)(ab93926）、GAPDH(ab181602）单克隆抗体、兔抗大鼠Bcl-2(ab196495）、p-GSK-3β(ab131097）、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)(ab8805）、p-AKT(ab38449）多克隆抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG(ab205718）（英国Abcam）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）试剂盒（货号：A001-3-2）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）试剂盒（货号：A003-1-2）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）试剂盒（货号：A044-1-1）（南京建成生物工程研究所）；巨噬细胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein 2,MIP2）（货号：CB26030245）、角质形成细胞趋化因子（keratinocyte chemoattractant,KC）（货号：CB15689957）、高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1）（货号：CB56082270）、IL-6（货号CB55647111) ELISA试剂盒（美国Biosource International）。Gel Doc XR+凝胶成像系统（美国伯乐公司）；RX51光学显微镜（日本Olympus）；多功能紫外酶标仪（美国Bio-Rad公司）；高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2方法

1.2.1动物分组、建模及给药

取60只SD大鼠分为6组（n=10）：假手术（Sham）组、模型组（CLP）、QUE 25 mg/kg组、QUE 50 mg/kg组、QUE 100 mg/kg组及阳性药物地塞米松（DEX）组，根据既往研究选择QUE使用剂量[7,8]。除假手术组外，其余5组均采用盲肠结扎穿孔术（CLP）构建脓毒症大鼠模型[9]。采用戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，常规消毒，沿大鼠下腹纵切约2 cm切口，剪开腹膜后暴露大鼠盲肠。然后将盲肠1/3处用缝合线结扎，同时用18号针头贯通盲肠末端穿孔2次，并挤出少许肠内容物。完成后将盲肠收回腹腔，逐层关闭腹腔，并进行消毒处理。假手术组大鼠在取出盲肠后不进行结扎穿刺，径直回纳至腹腔内。造模过程中未出现大鼠死亡情况，造模成功后2 h,DEX组腹膜内注射10 mg/kg DEX，根据张鸣号等[10]的研究确定DEX剂量。QUE各剂量组腹膜内分别注射槲皮素25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg,1次/d，连续7 d，假手术组和模型组腹膜内注射等量生理盐水。以各组大鼠造模时间为起始点，观察大鼠存活情况，以天为时间节点，共观察7 d，计算大鼠存活率。

1.2.2标本处理

其他60只SD大鼠随机分为6组(n=10），与上述实验分组及操作相同，给药7 d后，麻醉大鼠腹主动脉采血，分离血清，-80℃保存；颈椎脱臼处死大鼠，手术切取右肺上部，保存于10%中性甲醛溶液中；手术切取右肺下部，保存于液氮中。

1.2.3 HE染色观察肺组织病理变化

10%中性甲醛溶液固定肺组织24 h后常规脱水、透明和石蜡包埋。随后，将石蜡包埋的肺组织切成4µm厚的切片，二甲苯脱蜡，梯度浓度乙醇脱水，苏木精染色5 min，伊红染色2 min，封片，并在光学显微镜下观察肺组织病理学变化。根据肺水肿、出血和炎症细胞浸润的严重程度评分组织损伤，0分代表正常，1分代表温和，2分代表中等，3分代表严重，4分代表非常严重[11]。

1.2.4肺湿干重比（W/D)

分离大鼠左肺并称重以获得肺湿重，随后将左肺置于80℃烘箱中干燥至少48 h，干燥后称重以确定肺干重。计算肺W/D以评估肺水肿。

1.2.5 TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡

肺组织于10%中性甲醛溶液固定24 h后，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇洗脱后，PBS冲洗。蛋白酶K修复20min,3%H2O2室温反应5 min,PBS清洗2次，滴加25µl TdT酶于37℃反应60 min,PBS清洗3次，滴加25µl HRP抗体，37℃孵育30 min,PBS清洗3次。0.05%DAB显色4 min,PBS清洗3次，苏木精复染10 min,PBS清洗3次，脱水、透明、封片。每张玻片随机选取5个视野，记录阳性细胞数（棕色细胞）。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达

采用RIPA裂解液提取保存于液氮中的大鼠肺组织总蛋白，BCA测定总蛋白浓度。每孔上样量50µg,SDS-PAGE分离并电转至PVDF膜，室温下以5%脱脂奶粉液封闭膜2 h，加入一抗（GAPDH、Bax、Bcl-2、cleaved cas3、cleaved cas9、p-PTEN、PTEN、p-β-catenin、β-catenin、p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β，均1∶1 000稀释），4℃孵育过夜，添加HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶3 000）室温孵育2 h，洗膜，ECL发光显色，拍照。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.7检测肺组织和血清中炎症因子水平

取保存于液氮中的大鼠肺组织研磨匀浆后离心，吸取上清液。根据制造商说明，使用MPO活性测定试剂盒测定460 nm下吸光度以评估MPO活性，使用ELISA试剂盒测量肺组织上清液中MIP2和KC含量及血清中HMGB1和IL-6的水平。

1.2.8肺组织中SOD和MDA含量检测

根据试剂盒说明书测定肺组织中SOD和MDA的含量。

1.3统计学分析

数据表示为，使用GraphPad Prism 5.0进行数据统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠存活率

如图1所示，Sham组大鼠7 d生存率为100%,CLP组大鼠死亡率在7 d内高达90%(P<0.01）；与CLP组比较，QUE 25 mg/kg组大鼠生存率变化无统计学意义，QUE 50 mg/kg组和QUE100 mg/kg组大鼠生存率分别提高至40%和60%(P<0.05），且QUE 100 mg/kg组大鼠存活率与阳性对照DEX组差异无统计学意义。

2.2槲皮素对脓毒症ALI大鼠肺损伤的影响

如图2所示，在Sham组中，大鼠肺泡结构清晰、完整，CLP组中肺泡和间质水肿，肺泡壁增厚，大量炎症细胞浸润，肺损伤评分升高（P<0.01）。QUE 50 mg/kg和100 mg/kg治疗后肺组织病理变化显著缓解，炎症细胞浸润程度明显减轻，肺损伤评分降低（P<0.05,P<0.01）。

2.3槲皮素对脓毒症ALI大鼠肺组织凋亡的影响

如图3所示，Sham组肺组织仅具有少量阳性染色，凋亡细胞极少，CLP组中出现大量凋亡细胞，细胞凋亡率明显高于Sham组（P<0.01）。QUE 50 mg/kg和100 mg/kg组细胞凋亡率显著低于CLP组（P<0.05,P<0.01）。与Sham组相比，CLP组Bax/Bcl-2、cleaved cas3和cleaved cas9表达显著上调（P<0.01）；与CLP组比较，QUE 50 mg/kg和QUE 100 mg/kg组Bax/Bcl-2、cleaved cas3和cleaved cas9表达显著下调（P<0.01）。

图1 各组大鼠生存率   

图2 槲皮素对脓毒症ALI大鼠肺损伤的影响   

2.4槲皮素对脓毒症ALI大鼠肺水肿和炎症因子水平的影响

如图4A所示，与Sham组相比，CLP组肺组织W/D显著升高（P<0.05）。QUE 50 mg/kg和QUE 100 mg/kg治疗后，肺组织W/D显著降低（P<0.05）。如图4B～F所示，CLP组MPO活性和HMGB1、IL-6、MIP2和KC水平显著高于Sham组（P<0.01），而MPO活性和HMGB1、IL-6、MIP2、KC水平经QUE 50 mg/kg和100 mg/kg处理后明显降低（P<0.05,P<0.01）。

2.5槲皮素对脓毒症ALI大鼠肺组织氧化应激的影响

如图5所示，与Sham组相比，CLP组肺组织中SOD含量显著降低（P<0.01),MDA含量显著升高（P<0.01）。50 mg/kg和100 mg/kg QUE治疗后，大鼠抗氧化能力显著增强，且QUE 100 mg/kg和DEX组疗效差异无统计学意义。

图3 槲皮素对脓毒症ALI大鼠肺组织细胞凋亡的影响   

2.6槲皮素对脓毒症ALI大鼠肺组织PTEN/β-catenin和AKT/GSK-3β通路的影响

如图6所示，与Sham组相比，CLP组PTEN和β-catenin的磷酸化水平显著升高，而AKT和GSK-3β的磷酸化水平显著降低（P<0.01）；与CLP组相比，QUE 50 mg/kg组和QUE 100 mg/kg组中PTEN和β-catenin的磷酸化水平显著降低，AKT和GSK-3β的磷酸化水平显著升高（P<0.01）。

图4 槲皮素对脓毒症ALI大鼠肺水肿和炎症因子水平的影响   

图5 槲皮素对脓毒症ALI大鼠肺组织氧化应激的影响  

图6 槲皮素对脓毒症ALI大鼠肺组织PTEN/β-catenin和AKT/GSK-3β通路的影响

3、讨论

脓毒症是重症监护病房（ICU）死亡的主要原因，严重脓毒症常导致多器官功能障碍综合征，其中以ALI最为常见[12]。ALI的主要症状是肺部严重炎症反应导致肺泡内皮屏障破坏，中性粒细胞等炎症细胞浸润并伴随炎症和细胞毒介质释放，肺泡上皮细胞和效应T细胞的活化[13]。大量炎症渗出使肺泡内充满富含蛋白质的液体，从而影响肺泡的呼吸功能。表面活性剂的合成和代谢受损进一步破坏了患者的呼吸功能[14]。此外，由于大量炎症因子的破坏，肺组织的氧化与抗氧化平衡也遭到破坏[15]。因此，基于脓毒症诱导的ALI过度炎症反应和氧化应激的病理机制，筛选能有效治疗ALI的药物是当前的研究热点。本研究通过CLP成功构建了大鼠脓毒症ALI模型，QUE的处理降低了大鼠死亡率，减轻了肺组织炎症细胞浸润程度，并降低了病理损伤评分和W/D。肺水肿、炎症细胞浸润和肺泡出血被视为ALI的典型病理表现。因此，QUE对大鼠ALI具有显著保护作用。

QUE能通过上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达减少神经细胞凋亡，从而减轻脑出血后神经功能损伤[16]。本研究表明，QUE可抑制ALI诱导的细胞凋亡。促凋亡蛋白Bax是Bcl-2蛋白家族的重要成员，在胱天蛋白酶激活和线粒体凋亡途径中起着至关重要的作用，Bax/Bcl-2决定了细胞是否发生凋亡[17]。本研究证实通过QUE处理可逆转CLP诱导的Bax、cleaved cas3和cleaved cas9的高表达和Bcl-2旳低表达。因此，QUE可以抑制脓毒症ALI大鼠肺组织的细胞凋亡。

HMGB1诱导肺损伤的分子机制涉及多个炎症信号通路的激活[18]。WANG等[19]已证实在几种ALI小鼠模型中，灭活HMGB1可显著降低炎症性肺损伤，并提高小鼠存活率。此外，MPO的活化和MDA水平已被认为是肺组织炎症水平的指标[20]。SOD是体内重要的抗氧化酶，可以减轻氧自由基引起的肺部损伤。在本研究中，QUE可以降低MPO活性和MDA含量，以及HMGB1、IL-6和KC水平，增加SOD含量。研究表明肺上皮细胞凋亡导致促炎细胞因子的释放，从而引起炎症，而过度的炎症浸润可诱导氧化应激并进一步诱导细胞凋亡的发生[21]。因此，QUE通过抗炎、抗凋亡和抗氧化应激改善脓毒症引起的肺损伤。

据报道，PI3K/AKT信号通路调节肺炎症中的细胞存活和氧化应激，激活该通路可诱导脓毒症小鼠ALI时的内源性保护机制[22]。研究发现，槲皮素通过上调PI3K/AKT/mTOR通路减轻脓毒症小鼠心肌损伤[23]。PTEN是一种多功能磷酸酶，并调节其下游PI3K/AKT信号通路，已被证明在肺损伤中必不可少。PTEN活性的下调有利于PI3K/AKT通路的持续激活[24]。FAN等[25]认为抑制PTEN表达可减轻脂多糖诱导的小鼠ALI。本研究中，QUE治疗后，PTEN/β-catenin途径的磷酸化水平显著降低，AKT/GSK-3β途径的磷酸化水平显著升高，提示PTEN/β-catenin是AKT/GSK-3β的上游，并负调控AKT/GSK-3β通路的活化。因此推测QUE通过抑制PTEN/β-catenin信号通路和激活AKT/GSK-3β通路对脓毒症诱导的ALI具有保护作用。

综上所述，QUE在脓毒症ALI中起到抗凋亡，抗炎和抗氧化的药理作用，可以提高脓毒症ALI大鼠的生存率并显著改善CLP诱导的肺组织损伤，其具体机制可能通过调节PTEN/β-catenin和AKT/GSK-3β信号通路实现。以上结果为QUE对脓毒症ALI的作用机制提供理论依据，未来仍需进一步研究。

参考文献:

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[10]张鸣号,李桂忠,曹军.氧化苦参碱对脓毒症大鼠肺组织JAK/STAT信号通路的影响[J].中国中药杂志,2010,35(1):103-107.

[13]石恩朋,彭美玉.羟基酪醇对脓毒症诱导的急性心肺损伤的保护作用及机制[J].中国免疫学杂志,2019, 35(15):1814-1819,1824.

[16]涂鄂文,陈琼,宁敏,等.槲皮素对脑出血大鼠神经细胞凋亡与Bcl-2､Bax蛋白表达的作用研究[J].湖南中医药大学学报,2020,40(5):555-560.

[17]颜治云,张青,张梅.氧化苦参碱对人脐静脉内皮细胞体外缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制[J].解放军医药杂志,2019, 31(4):22-26.

[22]田磊,金屏,贺清,等. Akt/mTOR信号介导的自噬在盐酸小檗碱治疗小鼠心肌梗死损伤中的作用研究[J].解放军医药杂志,2019, 31(12):1-5.

[23]吴柳,蒋永艳,刘微,等.槲皮素通过PI3K/AKT/mTOR通路减轻脓毒症小鼠心肌损伤[J].中国急救医学,2021, 41(3):238-243.

基金资助:四川省科技厅应用基础研究项目(2020YJ0433);

文章来源:袁国娜,贺晓云,李志芳,等.槲皮素对脓毒症大鼠急性肺损伤及炎症和氧化应激的影响[J].中国免疫学杂志,2024,40(04):780-785.