脓毒血症是由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍综合征，每年全球有3 000多万人患脓毒血症[1]。脓毒症相关性脑病(sepsis associated encephalopathy, SAE)是脓毒血症引起的一种弥漫性脑功能障碍，约70%脓毒血症患者会并发SAE[2]。SAE不仅增加了脓毒血症患者的住院时长和死亡率，还会导致不可逆的认知功能障碍[1,3]。SAE的病理生理过程十分复杂，可能与脓毒血症诱导的神经炎症、氧化应激、血脑屏障破坏、大脑代谢失调等因素有关[4]。

从银杏干叶中提取的标准银杏叶提取物(ginkgo biloba extract, GBE)含有6%的萜类化合物、24%的黄酮苷类化合物，被认为是GBE的主要药理活性成分[5]。GBE被广泛应用于阿尔兹海默症、心血管疾病、痴呆、记忆丧失和脑缺血等疾病[6],具有抗炎、抗氧化、清除自由基和神经保护等多种功效[7,8]。但其对SAE的治疗机制尚不明确，有待进一步研究。

网络药理学是将生物信息学与系统药理学相结合的一种新兴的研究方法，因其具有能够阐明中药多成分、多靶点的特点而被广泛应用于中药研究[9]。本研究利用网络药理学的方法，从分子蛋白层面进一步探索GBE在SAE治疗中的具体机制，并通过分子对接实验对预测结果进行验证，为今后SAE的研究及临床用药提供理论支持和新思路。

1、资料与方法

1.1 银杏叶活性成分筛选

利用TCMSP中药系统药理学数据库,在“Herb name”检索栏中输入“银杏叶”检索出银杏叶活性成分，再设置口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%,类药性(drug-likeness, DL)≥0.18的选项，对银杏叶中的活性成分进行进一步筛选。

1.2 银杏叶活性成分相关靶点收集

将TCMSP数据库获得的活性成分靶点信息与UNIPROT数据库中已验证的人源蛋白质进行信息比对，并进行标准化处理，从而获得银杏叶活性成分靶点信息所对应的基因数据库，同时利用Cytoscape 3.9.1构建“银杏叶活性成分-靶点”网络图。

1.3 GBE治疗SAE潜在靶点收集

分别在OMIM数据库、GeneCards数据库、Drugbank数据库和Disgenet数据库中以“Sepsis-associated encephalopathy”作为关键词检索SAE相关靶基因，用R语言汇总数据，获得与该疾病相匹配的靶基因数据库。通过微生信jvenn插件获取银杏叶活性成分与SAE交集靶点，绘制Venn图。

1.4 交集靶点PPI网络构建与关键靶点筛选

将所得交集靶点导入String(https: //cn.string-db.org/),将物种选项设置为“Homo sapiens”,将最高可信度设置为“0.900”,进行蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)网络构建，将所得数据导入Cytoscape 3.9.1,利用CentiScaPe 2.2 Menu插件，根据度值(Degree>16.444)、介数中心性(Betweenness>152.622)及紧密中心值(Closeness>0.004)三个参数大于阈值来筛选关键靶点，通过度值大小绘制PPI网络。

1.5 GO分析及KEGG通路富集分析

使用R语言对银杏叶活性成分及SAE交集靶点进行基因本体(gene ontology, GO)分析及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析，包括生物过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)及分子功能(molecular function, MF)三个GO功能，并进行可视化处理。以P<0.05作为过滤值进行筛选。其中GO分析展示各项排名前8条目，KEGG通路富集分析展示前20条通路。

1.6 银杏叶活性成分与关键靶点分子对接

在“银杏叶活性成分-靶点”网络图中以度值高低为标准进行筛选，选取TOP 3的银杏叶活性成分与PPI网络中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase 1, AKT1)、肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor, TNF) 、白介素-6 (interleukin-6, IL-6)这三个与疾病关系密切且重要的潜在靶点进行分子对接。在TCMSP数据库检索相关活性分子并以“mol2”格式导出，利用String数据库和RCSB PDB(https: //www.rcsb.org/)数据库获取关键靶点的三维结构，将上述关键靶点(PDB蛋白)的三维结构导入Pymol软件，经去水、去配体处理后，以“pdb”格式导入Autodock软件，并将活性组分“mol2”格式文件与关键蛋白“pdb”格式文件进行分子对接验证。获得结合能，若小于-1.2 kcal·mol-1表示活性成分与关键靶点结合稳定[10],结合能与稳定性呈负相关。利用Pymol软件对蛋白分子对接进行可视化处理。

2、结果

2.1 银杏叶活性成分筛选结果

以“银杏叶”作为关键词在TCMSP数据库中检索出主要活性成分307个，进一步设置OB≥30%,DL≥0.18作为检索范围，初步确定银杏叶的活性成分为27个，详见表1。

2.2 银杏叶活性成分相关靶点收集结果

在TCMSP数据库中对27个活性成分进行靶点筛选，得到526个备选活性成分相关靶点。将所得靶点与Uniprot数据库进行信息比对，并进行标准化处理(去重),最终获得15种活性成分及198个靶点。运用Cytoscape 3.9.1对银杏叶活性成分靶点进行度值分析，检出前五位活性成分为：槲皮素、木犀草素、山奈酚、Beta-sitosterol、Sesamin, 详见图1。

表1 银杏叶的27个活性成分信息

图1 “银杏叶活性成分-靶点”网络  

2.3 GBE治疗SAE潜在靶点收集结果

将OMIM、GeneCards、Drugbank和Disgenet四个数据库中以“sepsis associated encephalopathy”作为关键词检索出的靶点通过R语言汇总取并集后共得到1 535个与SAE相关的靶点。将所得靶点与银杏叶活性成分的198个靶点导入微生信平台得到“银杏叶-SAE”交集靶点101个，绘制Venn图，见图2。

图2 “银杏叶-SAE”交集靶点Venn图  

2.4 交集靶点PPI网络构建与关键靶点筛选结果

将“银杏叶-SAE”的101个交集靶点导入到String数据库中，构建PPI网络，见图3,最高可信度设置为“0.900”,物种选项设置选为“Homo sapiens”后，得到101个节点，期待边线数为559条，实际所得边线数2 056条，平均节点度为40.7,平均局部聚类系数0.73,PPI富集P值<1×10-16。

图3 PPI网络   

确定TOP 5关键靶点为AKT1、肿瘤抑癌基因p53(tumor suppressor gene p53, TP53)、V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A(recombinant V-Rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A, RELA)、TNF及IL-6。将String数据库所得TSV文件导入Cytoscape 3.9.1,利用CentiScaPe 2.2 Menu插件，以Degree、Betweenness、Closeness三个参数大于阈值为界限来筛选关键靶点，详见表2。

表2 Top10-Hub基因

2.5 GO分析和KEGG通路富集分析结果

2.5.1 GO分析结果

运用R语言Cluster Profiler软件包对GBE治疗SAE的101个交集靶点进行GO分析，根据P<0.05,筛选结果(详见图4)。其中BP相关2 316条，CC相关69条，MF相关141条。分析结果显示，GBE治疗SAE的BP与其对脂多糖的反应、细菌源的响应、凋亡信号通路的调节及氧化应激反应等相关；CC可能包括膜筏、膜微结构域、胞膜窖、质膜筏及囊腔等；MF可能与细胞因子受体结合、细胞因子活性、转录共调节因子结合、信号受体激活活性及血红素结合等相关。

图4 银杏叶活性成分抗SAE靶点的GO分析  

2.5.2 KEGG通路富集分析结果

利用R语言Cluster Profiler软件包对101个GBE治疗SAE的交集靶点进行KEGG通路富集，以P<0.05作为筛选条件得到175条通路，通过分析发现GBE治疗SAE可能与磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/potein kinase B, PI3K/Akt)、白介素-17(interleukin-17, IL-17)、TNF、Toll样受体(toll-like receptors, TLR)及核因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)受体等信号通路相关，对前20条通路以气泡图的形式进行可视化分析(详见图5)。

图5 银杏叶活性成分抗SAE靶点的KEGG通路富集分析  

2.6 分子对接结果

以度值为筛选条件，利用AutoDock软件将所得银杏叶TOP 3活性成分(槲皮素、木犀草素、山奈酚)分别与PPI网络中的AKT1、TNF、IL-6关键靶点进行9次分子对接，结合能均小于-1.2 kcal·mol-1,见表3,表示银杏叶活性成分与SAE密切相关的关键靶点能够良好地结合。

表3 核心成分与关键靶点结合能

由表3可知，槲皮素与TNF、木犀草素与TNF、山奈酚与IL-6结合最为紧密，因此对此三组对接进行可视化展示，见图6。图中所示银杏叶活性成分以橘黄色分子结构展示并以黑色虚线圈出，其所附着成分为治疗SAE的关键靶点。槲皮素与TNF在天冬氨酸-31,丙氨酸-35,谷氨酰胺(glutamine, GLN)-125,精氨酸(arginine, ARG)-82,酪氨酸(tyrosine, TYR)-87处形成氢键。木犀草素与TNF在天冬酰胺-30,异亮氨酸-43,缬氨酸-41,甘氨酸(glycine, GLY)-40处形成氢键。山奈酚与IL-6在ARG-56,TYR-107,GLY-26,GLN-75,色氨酸-102处形成氢键，黄色虚线为氢键，其数值表示氢键的长度。

图6 银杏叶活性成分与靶蛋白分子对接  

3、讨论

SAE常伴有炎性因子上调、脑内细胞凋亡和认知功能障碍等症状。研究表明[11],这可能与进入脑组织的炎性细胞因子有关，进而导致机体氧化应激水平变化和脑细胞功能障碍。因此，抑制炎症和氧化应激反应可能是治疗SAE的主要策略。Liu等[6]发现，GBE可通过抑制NF-κB信号通路的转录和促炎细胞因子的表达来发挥抗炎作用。GBE还可抑制总一氧化氮合酶和诱导型一氧化氮合酶的活性，增强机体对一氧化氮的清除能力，从而提高脓毒血症患者组织氧合状态，减少28天的死亡率[12]。也有研究表明[13],GBE可通过抑制炎症、诱导小胶质细胞M2表型和改善脑缺血后的白质修复，从而促进脑卒中后的长期神经功能改善。

为了进一步探究GBE对SAE治疗的分子机制，本研究通过毒药物动力学分析和拓扑分析获取了银杏叶的15种活性成分，其中主要包括槲皮素、木犀草素、山奈酚等黄酮类化合物。槲皮素可通过阻断内皮细胞NF-κB和AP-1信号通路，抑制TNF-α所诱导的炎症反应和细胞凋亡[14],具有强大的抗氧化作用，抑制神经元氧化损伤从而起到保护神经元的作用[15,16]。木犀草素可通过上调Nrf2蛋白水平和清除自由基起到抗炎和神经保护的作用。其还可以调节RhoGTP酶从而自由穿越血脑屏障[17],对神经炎症产生直接影响[18]。最新研究表明[19],木犀草素可降低炎症和氧化应激、控制免疫反应和预防器官损伤，有利于脓毒血症的治疗。山奈酚具有抗炎和抗氧化的作用，并可显著提高脓毒血症动物模型的存活率[20]。研究发现[21,22],黄酮类化合物具有抗病毒、抗炎及心脏保护等多种功效。以上研究表明槲皮素、木犀草素、山奈酚等黄酮类化合物可能是GBE治疗SAE的潜在有效成分。

本研究通过对“银杏叶-SAE”的PPI网络分析发现AKT1、肿瘤抑癌基因p53(tumor suppressor gene p53, TP53)、V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A(V-Rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A, RELA)、TNF及IL-6这五个靶点可能在GBE治疗SAE中起到关键作用。AKT1作为中心节点存在于调节细胞存活的信号通路中，可抑制细胞凋亡信号传导[23],其介导的神经保护作用在缺血/缺氧的小鼠胶质细胞模型中得到了验证[24]。值得注意的关键靶点是TNF和IL-6。TNF最初被认为是一种引起肿瘤坏死的循环性因子，后被证实与炎症有关[25]。研究发现[26],TNF-α可通过激活蛋白激酶-6使血脑屏障通透性增加，并通过一氧化氮、胱天蛋白酶途径诱导细胞凋亡和脑水肿进而造成神经元损伤。IL-6是在感染和炎症的过程中起到关键作用的细胞因子[27],脓毒血症患者血清中IL-6水平随着时间的推移而增高，并与患者的认知障碍程度密切相关[28]。AKT1、TNF及IL-6等关键靶点的发现，表明GBE可能通过调节炎性因子水平来治疗SAE。将银杏叶活性成分与SAE密切相关的靶点通过AutoDock软件进行分子对接，结果均能进行良好的结合，进一步验证了此预测的可靠性。

GO分析结果表明，GBE对SAE的影响包括脂多糖反应、凋亡信号通路的调控和氧化应激在内的几种BP。其中氧化应激可导致线粒体功能障碍，进而造成长期记忆功能障碍[29]。据此，可以推测GBE通过负性调控氧化应激，改善SAE认知功能。KEGG通路富集分析结果表明，GBE治疗SAE涉及了多条通路，包括PI3K/Akt、TNF、IL-17、NF-κB和TLR等信号通路和癌症相关通路。PI3K/Akt信号通路可能是脓毒血症的一个新干预靶点，通过对PI3K/Akt信号通路的调节可以降低脓毒血症的发病率和死亡率[30]。TNF可与TNFR1和TNFR2两种不同受体结合，产生一系列由信号级联所导致的细胞反应，证实其在炎症中的核心作用[25]。研究表明[31],IL-17家族中的IL-17A是脓毒血症的生物标志物和治疗靶点，并在各种感染性疾病、炎症、自身免疫性疾病和癌症中都表现出关键作用。此外，通过调节NF-κB和TLR信号通路可抑制SAE的炎症反应和神经细胞凋亡[32,33]。

综上所述，本研究基于网络药理和分子对接的综合策略，通过多种成分、多个靶点和多条途径揭示GBE可通过抑制炎症、抑制氧化应激等方面在治疗SAE中发挥作用。这项研究的发现加深了我们对GBE治疗SAE复杂机制的理解，为今后的体内外实验提供了参考依据。

参考文献:

[10]曾晓涛,陈艳琰,乐世俊,等.基于网络药理学-分子对接-实验验证的地锦草效应物质基础与作用机制研究[J].中药新药与临床药理,2022,33(9):1205-1217.

[12]刘亚晶,李春明,亢宏山,等.舒血宁注射液对脓毒症患者Lac､Presepsin和NOS水平的影响[J].中成药,2017,39(9):1795-1799.

基金资助:云南省教育厅科学研究基金项目(No:2023Y0966);

文章来源:王旭,曲艳平,贺文廷等.基于网络药理学探讨银杏叶提取物治疗脓毒症相关性脑病的作用机制[J].巴楚医学,2024,7(01):97-103.