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不同浓度葡萄籽提取物原花青素对UVA照射HaCaT细胞表达AQP3、Caspase-14和BHmRNA的影响

2020-05-30 341 上传者：管理员

摘要：目的：通过研究UVA照射前后及不同浓度葡萄籽提取物原花青素干预的HaCaT细胞表达水通道蛋白3(AQP3)、半胱氨酸蛋白酶14(Caspase-14)和博来霉素水解酶(BH)mRNA的变化,探索GSPE是否能够修复长波紫外线引起的皮肤屏障损伤。方法：实验分为五个组:空白对照组、单纯光照组(选取UVA的能量密度为25J/cm2)、照光联合不同浓度GSPE干预组(10、50、100μg/mL),采用RT-PCR法分别检测各组AQP3、Caspase-14和BHmRNA的表达量。结果25J/cm2的UVA可以提高AQP3mRNA表达量。GSPE药物浓度大于10μg/mL时,随药物浓度增加,可以逐渐降低光照后高表达的基因水平,并呈浓度依赖性。UVA可下调BH和Caspase-14mRNA表达量,而GSPE可以提高光照后降低的基因表达量,且呈浓度依赖性,逐渐使其恢复正常。结论合适浓度的GSPE可以调节UVA对HaCaT细胞AQP3、Caspase-14和BHmRNA表达的影响,并使其趋于正常,推测其具有修复长波紫外线引起的皮肤屏障功能损伤的作用。

关键词：
HaCaT细胞
皮肤
皮肤屏障
葡萄籽提取物原花青素
长波紫外线
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皮肤是人体最大的器官,完整的皮肤屏障能够抵御外界紫外线等各种理化因素的入侵,同时具有保湿及调节免疫、抗炎作用。目前研究显示,水通道蛋白3、半胱氨酸蛋白酶14(Caspase-14)和博来霉素水解酶表达变化在皮肤屏障中发挥重要作用[1,2,3]。本研究通过检测不同浓度葡萄籽提取物原花青素对UVA照射HaCaT细胞表达AQP3、Caspase-14和BHmRNA的影响,探索GSPE是否能够修复紫外线引起的皮肤屏障功能损伤。

1、材料与方法

1.1细胞

HaCaT细胞由天津市中医药研究院附属医院中心实验室提供。

1.2主要仪器与试剂

紫外线光疗仪SS-03UVA(上海Sigma公司,灯管为philips,TL/09,波长320～400nm,波峰350～360nm),细胞培养箱HeraeusD-6450Hanau(上海跃进医疗器械厂);葡萄籽提取物原花青素(GSPE)(天津市尖峰天然产物研究开发公司惠赠),DMEM高糖液态培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、D-Hank′s液;TIANScriptcDNA第一链合成试剂盒,SuperRealPreMix(SYBRGreen)试剂盒(天根生化科技有限公司)。

1.3药物配制

称取一定量GSPE融于二甲基亚砜溶液(DMSO)中制成50mg/mL的母液,-20℃保存,临用时用新鲜D-Hank′s液调至终浓度。GSPE的实验浓度经预实验筛选后分别设定为10、50、100μg/mL。

1.4细胞培养和紫外线照射

将HaCaT细胞以密度为105/mL接种于25cm2培养瓶培养和传代,细胞对数生长期、密度近1×106/mL(融合度近80%)时进行实验。弃培养基,D-Hank′s液冲洗,6孔板加入约2mLD-Hank′s液形成细胞上液面。UVA剂量=UVA辐射度×时间(s)(单次照射),照射距离15cm。UVA辐照剂量经预实验筛选后设为25J/cm2。

1.5实验分组及处理因素

空白对照组、单纯光照组(25J/cm2的UVA照射)及照光加药组(1、2、3组药物浓度分别为:10、50、100μg/mL),共5组,实验重复3次。对培养在6孔板的HaCaT细胞予以25J/cm2的UVA照射后(除外空白对照组),弃缓冲液,换为DMEM高糖液态培养基,同时加不同浓度药物干预,继续培养箱孵育24h后收集细胞进行后续实验。

1.6RT-PCR法

引物序列根据Pubmed基因库提供的等位基因核苷酸序列设计,均由南京金瑞斯生物科技有限公司合成。首先提取总RNA后进行浓度和纯度的鉴定及完整性的检测。再以GAPDH为内参基因进行一系列荧光定量PCR反应。目的基因与内参的扩增斜率差值<0.1,可以应用△△Ct进行定量分析。

1.7统计学处理

所有数据用SPSS17.0进行统计,符合正态分布以x±s表示,多个样本均数比较用单因素方差分析,其中两两间比较用LSD法,显著性检验水准α=0.05。

2、结果

2.1AQP3mRNA的表达量

单纯光照组AQP3mRNA相对表达量比空白对照组高(P=0.01),说明光照可以提高AQP3mRNA表达量。随药物浓度增加,可以逐渐降低光照后高表达的基因水平,并呈浓度依赖性(与单纯光照组比,当药物浓度为50、100μg/mL时,P50μg=0.03,P100μg=0)。当药物浓度为100μg/mL时,可以使其表达接近正常水平,见表1。

2.2Caspase-14和BHmRNA的表达量

Caspase-14和BH基因相比空白对照组,光照组两基因相对表达量均降低(PCaspase-14=1.70×10-3,PBH=0.01),说明光照可以下调Caspase-14和BHmRNA表达量。照光加药组两基因表达量比单纯光照组均提高(PCaspase-14=1.20×10-3,PBH=0.02),且呈浓度依赖性,说明药物可以提高光照后降低的基因表达量。且药物浓度为100μg/mL时Caspase-14基因表达量接近正常水平;当药物浓度为50、100μg/mL时,可使BHmRNA的表达量接近正常水平,见表1。

表1各组AQP3、Caspase-14和BHmRNA相对表达量分析(x±s)

3、讨论

长期的紫外线(ultraviolet,UV)照射可导致光老化、皮肤癌已成共识,但往往忽略了其对皮肤屏障功能的影响,或者在防治光损伤的同时忽略了对皮肤屏障的修复。既往研究及本团队前期研究[4,5]证明,葡萄籽提取物原花青素GSPE是一种安全范围广、具有光保护作用的天然植物成分,本研究旨在观察其是否能通过调节皮肤屏障功能的重要相关指标,修复皮肤屏障,抵御紫外线的损伤。

皮肤物理屏障结构往往被形容为砖墙结构,角质形成细胞(keratinocytes,KCs)是其中最主要的“砖石”,可以产生细胞角蛋白及黏多糖等维持正常的皮肤渗透功能[6]。HaCaT细胞保留了表皮细胞的大部分分化能力,与正常人角质形成细胞在生物学特性上极为相似,因此本实验选取HaCaT细胞为靶细胞进行皮肤屏障功能的相关研究。丝聚蛋白(filaggrin,FLG)就是KCs产生的、构成皮肤角质层的主要结构蛋白,也是角质层形成和发挥水合作用的关键。当细胞从颗粒层移行至角质层后,丝聚蛋白原在Caspase-14的催化下迅速去磷酸化成丝聚蛋白,而丝聚蛋白在BH的催化下进一步水解成天然保湿因子。Caspase-14和BH是其形成的关键酶,与天然保湿因子含量正相关[7]。目前认为,Caspase-14可以作为评价皮肤屏障功能的重要指标[8,9]。近期有研究表明干燥皮肤的BH是低表达的[10],有实验也显示体外培养的HaCaT细胞经较高剂量的NB-UVB照射后,Caspase-14和BH的表达均显著下降[2]。本研究证实,UVA也可降低二者的表达。不同浓度的GSPE作用于照射后的HaCaT细胞,可上调Caspase-14和BH基因的表达,以形成更多的天然保湿因子,减少水分的流失,修复受损的皮肤屏障。

水通道蛋白3(aquaporin3,AQP3)是一种双向转运水、甘油和尿素的通道,还能协同中间丝相关蛋白共同修复皮肤屏障。近期有实验研究[11]表明,低于15J/cm2的UVA照射可提高人类成纤维细胞AQP3mRNA的表达,但是不足以引起细胞光损伤,而高剂量30、50J/cm2的UVA照射可降低AQP3的表达。本实验中,25J/cm2紫外线照射后AQP3表达升高,可能与Caspase-14和BH表达降低从而造成天然保湿因子生成减少有关。AQP3的高表达是天然保湿因子减少的一种反馈,以此抵抗紫外线的损伤,进行自我保护。这种结果和有关报道一致[12]:在皮肤屏障破坏后24h内,减少的中间丝相关蛋白表达逐渐恢复,而AQP3明显增高,推迟其作为迟发反应接替中间丝相关蛋白的作用,以此确保细胞有足够的水环境来重建皮肤屏障。不同浓度的葡萄籽原花青素GSPE作用于照射后的HaCaT细胞,可以降低高表达的AQP3,且随药物浓度的升高,降低的越明显。GSPE的这种作用,可以恢复AQP3的正常表达量,由于AQP3具有水和甘油的双向转运作用,降低AQP3的含量也可以使经皮水分丢失减少,起到保护作用。同时AQP3高表达与特应性皮炎、皮肤肿瘤存在一定相关性[13],所以调节高表达的AQP3也有重要意义。

葡萄籽提取物原花青素GSPE是迄今为止发现的最高效的植物来源的抗氧化剂之一,是一种很好的自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂[14],其强抗氧化活性比VitC、VitE及β-胡萝卜素等更强,已为国内外众多体内体外实验所验证。Mantena等[15]报道GSPE可抑制紫外线诱导的过氧化氢(H2O2),脂质过氧化反应,蛋白质氧化,DNA损伤及非细胞体系中的羟基自由基和超氧化物阴离子的清除,也可抑制紫外线诱导的抗氧化系统的损耗,同时可抑制角质形成细胞MAPK和NF-κB信号的激活,进而减轻紫外线辐射诱导的氧化应激反应。本研究显示,葡萄籽提取物原花青素GSPE能够调节UVA诱导的HaCaT细胞AQP3、Caspase-14和BHmRNA的表达,通过调节这些皮肤屏障功能相关的重要评价指标来修复紫外线照射诱导的皮肤屏障功能损伤。希望未来葡萄籽提取物原花青素能更为广泛地应用于皮肤医学美容领域。

参考文献：

[2]宋秀祖,宋为民,许爱娥,等.AQP3､Caspase14､博来霉素水解酶对慢性湿疹皮肤屏障的作用研究[J].中华皮肤科杂志,2012,45(2):83-86.

[3]黄树英,涂颖,何黎,等.水通道蛋白3与皮肤屏障相关性研究进展[J].皮肤科学通报,2017,34(4):383-387.

[4]史先花,张峻岭,康元.葡萄籽原花青素及UVA照射对HaCaT细胞增殖活性的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2016,15(3):136-138.

[5]康元,张峻岭,史先花,等.葡萄籽提取物原花青素对长波紫外线诱导皮肤成纤维细胞表达TGF-βRⅡ与Smad7的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2015,14(6):341-343.

[6]吴媛媛,郑洁,肖风丽.角质形成细胞与特应性皮炎相关研究进展[J].中国麻风皮肤病杂志,2019,35(1):54-56,60.

[12]唐桦,李吉,谢红付,等.AQP3在不同年龄段正常人皮肤组织中的表达及意义[J].中国现代医学杂志,2010,20(22):3423-3425.

[13]张静霞,黎兆军.AQP3在皮肤病发病机制中的作用研究进展[J].医学综述,2013,19(17):3101-3103.

[14]张峻岭,史先花.紫外线诱导的皮肤屏障功能损伤与葡萄籽原花青素的保护作用[J].皮肤科学通报,2017,34(4):419-425.

史云容,张峻岭,康元.葡萄籽提取物原花青素对UVA照射HaCaT细胞表达AQP3､Caspase-14和BHmRNA的影响[J].中国皮肤性病学杂志,2020,34(06):640-643.