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基于巨噬细胞和斑马鱼炎症模型研究地肤子总黄酮的抗炎机制

2025-04-26 87 上传者：管理员

摘要：目的：研究地肤子总黄酮对巨噬细胞炎症模型、斑马鱼皮肤炎症的作用，探讨其抗炎机制。方法：通过体外建立LPS诱导RAW264.7巨噬细胞模型和体内建立SLS诱导斑马鱼皮肤炎症模型，采用CCK-8法检测不同浓度地肤子总黄酮处理的巨噬细胞存活率，ELISA法检测地肤子总黄酮处理巨噬细胞分泌炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ的水平变化，采用荧光显微观察斑马鱼皮肤中性粒细胞募集情况，评价地肤子总黄酮对斑马鱼炎症模型的作用。结果：细胞实验结果显示，100μg/mL地肤子总黄酮对正常巨噬细胞及LPS诱导的巨噬细胞均有显著的抑制作用，用地肤子总黄酮处理12h后，巨噬细胞中的IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ以及IL-8的表达量均显著降低（P<0.05,P<0.01,P<0.001）；斑马鱼实验结果显示，与正常对照组相比，SLS诱导模型组斑马鱼背部和腹部皮肤中性粒细胞数量显著增加（P<0.001），表现出明显的中性粒细胞迁移，50、100、200μg/mL地肤子总黄酮处理后，能显著抑制中性粒细胞迁移，且呈剂量依赖性。结论：地肤子总黄酮通过抑制巨噬细胞的生长、巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ以及IL-8的表达和中性粒细胞的迁移抑制表皮炎症浸润，从而发挥抗炎作用。

关键词：
地肤子总黄酮
巨噬细胞
斑马鱼
炎症模型
特应性皮炎
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特应性皮炎（atopicdermatitis，AD）是婴幼儿常见的慢性皮肤炎症性过敏疾病，主要是由遗传改变、皮肤屏障受损、免疫紊乱、皮肤微平衡破坏、环境因素等造成［1-2］，其主要临床表现为湿疹样皮肤受损、慢性或复发性炎症和频繁性皮肤瘙痒，严重者甚至导致继发性细菌感染以及其他过敏性表现［3-4］。临床常使用皮质类固醇类药物、非甾体抗炎药、抗组胺药、免疫抑制剂等进行治疗，但是由于不良反应频发和药物耐药等问题，对于疾病控制不充分或治疗不耐受的患儿，迫切需要更安全有效、可长期使用的药物［5-7］。研究表明，中药及其有效组分对AD患者的皮炎症状评分、生活质量改善情况显著优于抗组胺药、糖皮质激素等化学药物，且具有副作用小、不易耐药等优势［8-12］。地肤子为黎科植物地肤［Kochiascoparia（L.）Schrad.］的干燥成熟果实，其性寒、味甘苦，具有清热利湿、祛风止痒等功效，常用于治疗风疹、湿疹、皮肤瘙痒等［13］。课题组前期研究发现，地肤子总黄酮（FK）对AD炎症大鼠表现出良好的药理作用［14］，但FK提取物作用机制尚不完全清楚。基于此，本研究选用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导RAW264.7体外细胞炎症模型和十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfonate，SLS）诱导斑马鱼皮肤炎症模型，采取CCK－8、ELISA、荧光显色等实验技术手段，从细胞及动物层面对FK的抗炎活性及作用机制进行探讨。

1、仪器与材料

1.1　主要仪器

高速离心机（型号：Centrifuge5424，德国eppendorf公司）；二氧化碳细胞培养箱（型号：WJ－3－160，上海跃进医疗器械有限公司）；立式压力蒸汽灭菌锅（型号：YXQ－70A，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；光学显微镜（型号：CX41，日本OLYMPUS公司）；酶标分析仪（型号：RT－6100，深圳雷杜生命科学股份有限公司）。

1.2　实验材料

地肤子中药材（批号：20170428，湖南衡东县中药饮片厂）；地肤子总黄酮为课题组自制（纯度99.3%）；芦丁对照品（批号：3920，上海诗丹德生物技术有限公司）；脂多糖（LPS，L4391，美国Sigma公司）；DMEM高糖基础培养基（货号：WHB823P261，武汉普诺赛生命科技有限公司）、PBS缓冲液（货号：WHB823E021，武汉普诺赛生命科技有限公司）、青霉素－链霉素溶液（货号：WHAB23P058，武汉普诺赛生命科技有限公司）；细胞增殖－毒性检测试剂盒CCK－8（批号：041123230809，上海碧云天生物技术有限公司）；细胞培养级二甲基亚砜DMSO（批号：221V031，北京索莱宝科技有限公司）；胎牛血清（批号：23060706，浙江天杭生物科技股份有限公司）；IL－1β、IL－6、TNF－α、IFN－γ、IL－8ELISA检测试剂盒（批号：R231016－006a、R231016－003a、R231016－102a、R231016－100a、R231016－004a，深圳欣博盛生物科技有限公司）。

1.3　细胞株与实验动物

小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7（中国科学院细胞库）；实验斑马鱼饲养环境：28℃的专业养鱼用水；实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2022－0004，饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号：001458）的相关要求。

2、方法

2.1　地肤子总黄酮的制备

取地肤子中药材加80%乙醇回流提取，大孔树脂吸附24h，采用30%、40%和50%乙醇洗脱富集，减压干燥即得地肤子总黄酮干膏（提取率为1.18%）。以芦丁为对照品，采用硝酸铝显色法测定总黄酮有效部位含量为85.64%。

2.2LPS诱导RAW264.7细胞模型的建立

取对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板（4×105个/孔），培养2h，分别用含终浓度0、0.1、1、10、100、1000ng/mL的LPS培养基处理RAW264.7细胞12、24h后，每孔加入10%CCK－8试剂孵育1h，于450nm处检测吸光度值，确定LPS最佳诱导浓度。

2.3　细胞培养及细胞活力测定

取对数生长期的RAW264.7细胞置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。取对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板（4×105个/孔），37℃培养24h，用浓度分别为0、10、20、40、80、100µg/mL的含FK培养基溶液孵育24h。FK对LPS诱导的巨噬细胞活力影响：每孔加入含LPS00ng/mL的培养基，分别用上述浓度的FK培养基分别处理细胞24h，每孔加入10µL10%CCK－8，于培养箱中避光孵育90min，使用酶标仪测量在450nm处吸光度（A）值，按下列公式计算细胞活力。细胞活力=AA给药孔对照孔×100%

2.4ELISA法检测

细胞炎性因子含量取对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板（8×105个/孔），培养2h，每孔加含LPS100ng/mL的培养基25µL，分别用终浓度0、10、20、40µg/mLFK培养基处理RAW264.7细胞12、24h后，离心，收集细胞上清液，用ELISA试剂盒检测炎症因子IL－1β、IL－6、TNF－α、IFN－γ以及IL－8的表达水平。

2.5　斑马鱼的饲养及分组

实验动物斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550µs/cm；pH值为6.5～8.5；硬度为50～100mg/LCaCO3），转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼Tg（mpx：EGFP），以自然成对交配繁殖方式进行年龄为120hpf的斑马鱼用于实验。将斑马鱼分为正常对照组、SLS模型组和供试品组（供试品通过溶解到标准稀释水中的方式接触到斑马鱼皮肤）。正常对照组不做处理，SLS模型组仅用SLS处理，供试品组在用SLS的同时添加受试样品。

2.6FK对斑马鱼存活率的影响

随机选取120hpf转基因中性粒细胞绿色荧光MPX品系斑马鱼于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼，分别水溶给予样品（浓度为50、100、200、500、1000µg/mL），同时设置正常对照组和SLS模型组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组与SLS模型组同时水溶给予200µmol/LSLS建立斑马鱼皮炎模型。28℃处理48h后，测定斑马鱼的存活率。

2.7　斑马鱼皮肤中性粒细胞募集情况

将SLS诱导的转基因斑马鱼置于50、100、200µg/mL的培养基中培养48h，在显微镜下直接观察斑马鱼背部和腹部皮肤中性粒细胞数量。2.8　统计学方法使用IMBSPSSstatistics30统计软件分析，计数资料用xˉ±s表示，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1不同浓度LPS对RAW264.7细胞活力的影响

细胞毒性结果显示，当LPS浓度≤100ng/mL时，RAW264.7细胞活力均未受到显著影响。因此，本研究选用LPS100ng/mL诱导细胞炎症模型。见表1。

表1　不同浓度LPS对RAW264.7细胞活力的影响

3.2　不同浓度FK对对照组和LPS模型组RAW264.7细胞活力的影响

对照组RAW264.7细胞经100µg/mLFK处理后，细胞活力明显减弱（P<0.05）；LPS模型组RAW264.7细胞经80、100µg/mLFK处理后，细胞活力明显减弱（P<0.05，P<0.01）。见表2。

表2　不同浓度FK对两组RAW264.7细胞活力的影响

3.3　各组细胞炎性介质含量比较

LPS诱导RAW264.7细胞12、24h后，细胞处于急性炎症状态，RAW264.7炎症细胞因子IL－1β、IL－6、TNF－α、IFN－γ以及IL－8均显著增加（P<0.001）。不同浓度FK给药12h后，对IL－1β、IL－6、TNF－α、IFN－γ以及IL－8均有显著的抑制作用，IL－1β、IL－6以及IFN－γ在40µg/mL抑制作用最强，且呈现明显的剂量依赖性。不同浓度FK给药24h后，FK对IL－1β、IL－6、TNF－α、IFN－γ以及IL－8均有显著的抑制作用，40µg/mLFK对IL－6、IFN－γ在抑制作用最强且有明显的剂量依赖性，且FK对IL－1β、TNF－α、IL－8的抑制作用在实验浓度范围内抑制水平相当。见表3和表4。

表3FK孵育12h对各组细胞IL－1β、IL－6、TNF－α、IFN－γ和IL－8的影响

3.4　不同浓度FK对斑马鱼存活率的影响

不同浓度FK对斑马鱼存活率的影响结果见表5。在本实验条件下，FK对斑马鱼的最大存活浓度为500µg/mL。

3.5　不同浓度FK对SLS诱导斑马鱼中性粒细胞募集的影响

中性粒细胞募集结果表明，与正常对照组相比，SLS模型组斑马鱼背部和腹部皮肤中性粒细胞数量明显增加（P<0.001），出现表皮炎症细胞浸润。见图1。与SLS模型组相比，50、100、200µg/mLFK均能显著降低斑马鱼背部和腹部皮肤中性粒细胞数量，且呈现剂量依赖性。见表6。

表4FK孵育24h对细胞炎症模型细胞因子分泌的影响

表5　不同浓度FK对斑马鱼存活率的影响

图1FK对SLS刺激的斑马鱼皮肤中性粒细胞荧光募集的影响

表6　不同浓度FK对SLS诱导斑马鱼中性粒细胞募集的影响

4、讨论

特异性皮炎是临床上常见的一种皮肤慢性炎症，以婴幼儿时期发病率最高［15］。相关流行病学调查显示，我国和世界儿童特异性皮炎发病率均呈明显上升趋势，患病率分别约为1.95%和3.96%［16-17］。研究表明，多数慢性炎症性疾病的发生与炎症消退功能异常有密切的关系，在AD发病过程中，炎症反应是导致病程进展和转为慢性疾病的重要原因［18-20］。随着抗原的入侵，组织中免疫系统被激活，释放大量炎性因子和趋化因子，募集免疫细胞从而引起炎症反应。在本研究中，LPS诱导的巨噬细胞相关炎性因子IL－1β、IL－6、TNF－α、IFN－γ以及IL－8均显著增加，经FK处理后，LPS诱导的巨噬细胞数量和炎性因子均显著减少（P<0.05），并且高浓度的FK具有更强的抑制作用，表明FK抗炎活性呈现一定的剂量依赖性。

中性粒细胞是应对炎症损伤而应答产生的免疫细胞之一，观察中性粒细胞数量是反映炎症发展的重要指标之一［21］，斑马鱼模型能更好地观察中性粒细胞迁移［22］。十二烷基磺酸钠（SLS）是人体皮肤刺激物模型斑贴试验常见的阳性对照物，能诱发表皮炎症细胞浸润，刺激物进入斑马鱼体内诱导炎症反应，中性粒细胞发生免疫应答，向皮肤表皮迁移并聚集［23-25］。在本研究中，选用带有绿色荧光蛋白的转基因品系斑马鱼，在荧光显微镜下中性粒细胞呈现绿色荧光，荧光点数量即对应斑马鱼体内中性粒细胞数量［26-27］。和正常对照组相比，SLS诱导斑马鱼皮肤表面中性粒细胞数量显著增加（P<0.001），经FK处理后，SLS诱导斑马鱼皮肤表面中性粒细胞数量显著减少（P<0.01，P<0.001），并且高浓度的FK具有更强的抑制作用，表明FK抑制表皮炎症浸润效果呈现一定的剂量依赖性。

5、结论

地肤子总黄酮通过抑制巨噬细胞的生长、巨噬细胞炎症因子IL－1β、IL－6、TNF－α、IFN－γ以及IL－8的表达和中性粒细胞的迁移来抑制表皮炎症浸润。

参考文献:

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