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PTPRO通过减少STAT3磷酸化抑制黑色素瘤的恶性行为

2024-03-28 147 上传者：管理员

摘要：目的探讨酪氨酸磷酸酶O型变体(PTPRO)对黑色素瘤恶性行为的抑制作用及可能机制。方法应用针对人PTPRO基因启动子区的小激活RNA过表达黑色素瘤B16-F10细胞中的PTPRO,利用CCK8、平板克隆形成实验、划痕愈合实验、Trannswell小室迁移和侵袭实验分别检测激活PTPRO后黑色素瘤B16-F10细胞的存活、增殖、迁移和侵袭能力的改变。并用Western blot检测STAT3和磷酸化的STAT3的表达变化。结果 PTPRO-saRNA组显著抑制黑色素瘤B16-F10细胞的活力(P<0.01)、克隆形成能力(P<0.01)、划痕愈合能力(P<0.01)、迁移和侵袭能力(P<0.01);而且，过表达PTPRO减少STAT3蛋白的磷酸化。结论过表达PTPRO通过减少STAT3的磷酸化抑制皮肤黑色素瘤的恶性行为。

关键词：
STAT3
磷酸化
耐受性
酪氨酸磷酸酶O型变体
黑色素瘤
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黑色素瘤，通常是指恶性黑色素瘤，是黑色素细胞来源的一种高度恶性的肿瘤，多发生于皮肤，也可见于黏膜和内脏。虽然近年来黑色素瘤发病率已逐年稳定，尤其在男性中50岁以下成年人的发病率从2014-2018年每年下降了1%[1],但传统黑色素瘤的治疗方法如手术、化疗和放疗等疗效欠佳，患者耐受性差，不能显著改善患者预后[2]。随着医学的进步，从分子水平介入，能为提高黑色素瘤诊疗提供很好的思路。受体型酪氨酸磷酸酶O型受体(PTPRO)属于蛋白酪氨酸磷酸酶超家族的成员，是内在膜蛋白参与调节细胞内的酪氨酸磷酸化[3],在许多肿瘤中发现其异常表达，如乳腺癌[4],呈现低表达趋势，并且有研究表明PTPRO可在多种癌症中起预后标志物和肿瘤抑制子的作用[5,6]。但尚未有研究探索PTPRO与黑色瘤的关系。

1、材料与方法

1.1 材料

黑色素瘤B16-F10细胞株购自于中国科学院(上海)细胞库。胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培养基购自Hyclone公司。转染试剂lipofectamine2000购自Invitrogen公司。Transwell小室及matrigel基质胶购于美国Corning公司。STAT3单克隆抗体、Phospho-STAT3多克隆抗体和内参GAPDH兔单克隆抗体均购自Abclonal公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将黑色素瘤B16-F10细胞株放置在37℃,体积分数为5% CO2的恒温细胞培养箱中常规培养。培养液选用含10%的FBS,并添加双抗(质量浓度为100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素组成)的1640培养基。

1.2.2 细胞转染与分组

当黑色素瘤B16-F10细胞汇合度达到50%左右时，开始进行saRNA转染。三对PTPRO saRNA和PTPRO control根据文献报道的方法[7]予以设计，交付北京擎科生物科技有限公司合成，saRNA序列见表1。将PTPRO saRNA、saRNA control按lipofectamine 2000转染试剂说明书操作，转染后收集细胞用于后续实验处理，准备提取蛋白。Western blot检测saRNA激活效率，激活效率最高的一组saRNA将被用于剩余实验。剩余实验中，转染PTPRO saRNA的黑色素瘤B16-F10细胞，记为PTPRO-saRNA组，转染saRNA control后的黑色素瘤B16-F10细胞记为control-saRNA组。

表1 saRNA序列表

1.2.3 CCK8法检测细胞增殖活性

收集对数生长期的PTPRO saRNA细胞和control saRNA细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL后，接种在96孔板中，每组设置6个复孔，于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养24h后，将PTPRO saRNA和control saRNA细胞分为两组后每孔加入10μL的CCK8,37℃培养2h, 波长510nm下用酶标仪测定吸光度，重复实验3次，计算各组细胞增殖抑制率，结果以(均数±标准差)表示。

1.2.4 划痕愈合实验检测横向迁移能力

将处于对数生长期的PTPRO saRNA细胞和control saRNA细胞消化离心重悬浮成单细胞悬液后，种入六孔板，每种细胞设3个复孔，常规培养，待细胞密度达95%左右时将PTPRO saRNA和control saRNA细胞分为两组，随后所有样品用1mL蓝色tip头在底部划出一道无细胞划痕，继续常规培养，于12、24和48h拍照，观察伤痕愈合情况，以伤痕愈合率来评价横向迁移能力，伤痕愈合率(%)=细胞迁移面积/原始伤痕面积×100%。

1.2.5 Transwell小室检测纵向迁移能力

在Transwell下室加入含20%FBS的培养基650μL,Transwell上室加入无血清细胞悬液100μL,细胞含量约为2×104个(细胞分为：PTPRO saRNA组、control saRNA组),放置在细胞培养箱中培养24h。将Transwell小室放置在含量为4%的多聚甲醛溶液中，室温下固定20min后，用0.1%浓度的结晶紫染色10min, 再用棉签轻轻擦去小室内的细胞，用PBS液清洗3次，每次5min左右。然后将小室风干，在显微镜下取6个视野，并记录每个视野下的细胞数量，取平均值，结果用(均数±标准差)表示。

1.2.6 Transwell检测侵袭能力

先将matrigel基质胶从-20℃冰箱中取出，放在4℃冰箱中冷藏解冻，按照1∶8的比例用无血清培养基稀释，在每个小室加入稀释后质胶80μL,在37℃的细胞培养箱中放置30min, 待基质胶凝固后，再按照迁移能力的步骤开展后续实验，记录并计算细胞数量，所得数据即为细胞侵袭数。

1.2.7 免疫印迹

收集两组B16-F10细胞(PTPRO saRNA组、control saRNA组),RIPA强裂解液裂解细胞后抽提总蛋白，测定各组细胞的蛋白浓度后上样，10%SDS-PAGE胶予以电泳分离蛋白，转膜后5%牛血清白蛋白封闭非特异性蛋白，孵育一抗过夜(兔抗人PTPRO抗体1∶1000,兔抗人STAT3抗体1∶1000,兔抗人磷酸化STAT3抗体1∶1000;兔抗人GAPDH抗体1∶1000稀释),二抗室温孵育1h, ECL化学发光液予以显色曝光，ImageJ软件予以半定量。

1.3 统计学方法

应用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析并用GraphPad Prism 5做统计图，采集的数据用表示，并用独立样本t检验，P<0.05视为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 saRNA转染结果

三种saRNA(saRNA-1、saRNA-2和saRNA-3)中saRNA-3组的PTPRO表达量最多，故剩余实验均用saRNA-3组细胞进行，并简称为PTPRO-saRNA组，结果见图1。

图1 三种saRNA(saRNA-1、saRNA-2和saRNA-3)转染后Westernblot结果

2.2 CCK8细胞活性结果

PTPRO-saRNA组与control saRNA组相比，PTPRO-saRNA组的细胞活性明显被抑制(P<0.01),抑制率达到50%以上；表明上调PTPRO的表达可以抑制黑色瘤B16-F10细胞的活性，结果见图2。

图2 细胞活性

2.3 划痕愈合实验结果

两组细胞划痕48h左右，control saRNA组划痕基本愈合，而PTPRO-saRNA组的划痕愈合能力即横向迁移能力明显被抑制(P<0.01),结果见图3。

图3 细胞划痕愈合实验

2.4 Transwell迁移和侵袭结果

与control saRNA组相比，PTPRO-saRNA组B16-F10细胞的纵向迁移和侵袭能力明显被抑制，抑制率达60%以上(P<0.01),表明上调PTPRO基因的表达可以抑制黑色素瘤的横向迁移和侵袭，结果见图4。

图4 Transwell迁移和侵袭结果

2.5 p-STAT3表达结果

PTPRO-saRNA组和Control-saRNA组的STAT3没有明显差异(P>0.05);与control-saRNA相比，PTPRO-saRNA组中的磷酸化STAT3明显被抑制，说明PTPRO是通过减少STAT3的磷酸化抑制皮肤黑色素瘤，结果见图5。

图5 p-STAT3表达结果

3、讨论

黑色素瘤作为一种具有高度侵袭和转移特征的肿瘤[8],在我国发生率和死亡率比例明显高于全球平均水平[9]。虽然近年来肿瘤的治疗手段有所创新，如免疫治疗、靶向治疗和联合治疗，以致大多数局部黑色瘤的患者是可以治愈的，但是其局部复发和转移的风险仍然很高，其中皮肤黑色瘤的复发和转移率为30%～60%,黏膜黑色瘤的复发和转移率为59%～100%[10],表明黑色素瘤预后差、易转移的现状仍未有改善，同时因治疗方法敏感性差、毒副作用强和耐药性等因素，导致这些治疗方法的疗效有限[11]。随着分子生物学的不断发展，从分子、基因层面研究黑色素瘤的发生发展机制，寻找到黑色素瘤发生发展的标志物，不仅能够从黑色素瘤的增殖、侵袭、转移更加深入的了解肿瘤的发生发展，而且还对肿瘤的临床早期诊断、治疗有效靶点有着重要意义。

PTPRO起初是在人的肾小球中被发现和克隆出来，随后，Motiwala等[12]发现在肝癌中通过过表达PTPRO可以抑制肝癌细胞和裸鼠模型的生长，Zhao 等[13]发现在小鼠乳腺癌模型中，PTPRO与肿瘤生长、转移密切相关；同时PTPRO可以通过下调信号传导因子和转录因子(STAT3)抑制细胞的增殖并促进细胞凋亡[14]。随后不断有研究表明PTPRO与肿瘤的发生发展密切相关，并对其作用机制进行了一系列探索研究，如PTPRO与免疫信号传导和免疫细胞浸润的激活有关[15,16]、调节NF-κB[17,18]等。在部分肿瘤细胞中发现PTPRO的异常甲基化，并以此特征作为肿瘤预后不良的标志物[6,19,20,21]。

PTPRO作为一个跨膜蛋白，它的细胞内域包含PTP域，该域能够催化酪氨酸残基的脱磷酸化。PTP的去磷酸化对于信号转导必不可少，可显著影响和调节细胞的生物学行为，如增殖与分化、凋亡[22]。而STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)通过信号转导后二聚化和核转位后作为转录因子通过上调cyclin D、c-Myc等下游靶点促进癌细胞增殖、通过上调BCL-2 (B-cell cell/lymphoma-2)和BCLXL (B-cell lymphoma-extra large)等靶点促进细胞凋亡[14]、通过E-钙调蛋白和AKT2等促进癌细胞转移和侵袭[23,24]。目前尚未有研究表明PTPRO可以通过抑制STAT3的磷酸化发挥抑制黑色瘤的作用。本次研究中，运用小激活RNA即saRNA上调黑色瘤B16-F10细胞中PTPRO的表达，并用STAT3激活剂colivelin和转染control saRNA组进行一系列实验包括CCK8、划痕愈合实验、transwell迁移和侵袭实验以及凋亡实验，发现PTPRO与STAT3的磷酸化确实存在某种联系，Western blot实验进一步揭示PTPRO可以通过抑制STAT3的磷酸化发挥抗黑色瘤作用。该研究为PTPRO作为癌症治疗靶点提供了新的证据。

参考文献:

[2]张颖,周晓鸿.黑色素瘤靶向及免疫治疗现状与进展[J].皮肤病与性病,2021,43(4):475

[19]刘真真,潘妍,胡辉歌.脂肪非典型钙黏蛋白4及O型蛋白酪氨酸磷酸酶受体与胃癌预后的关系研究[J].癌症进展,2022,20(3):3

[21]李超超,刘鹏.PTPRO基因启动子甲基化在大肠癌中的表达及作用[J].湖南师范大学学报(医学版),2015,12(2):16

基金资助:国家大学生创新创业训练计划项目(202010927001);湖北省大学生创新创业训练计划项目(S202110927030);

文章来源:陈攀,李彦,王佳慧等.PTPRO通过减少STAT3磷酸化抑制黑色素瘤的恶性行为[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(02):127-131.