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骨化三醇与益生菌对帕金森小鼠模型行为学影响对照研究

2024-03-30 6 上传者：管理员

摘要：目的探究骨化三醇、益生菌对帕金森病(PD)小鼠模型行为学的影响。方法雄性SPF级健康C57BL/6小鼠45只，随机分为A组(正常对照，n=5)、B1组(PD模型对照，n=10)、B2组(PD模型益生菌干预，n=10)、B3组(PD模型骨化三醇干预，n=10),B4组(PD模型益生菌联合骨化三醇干预，n=10)。每组均连续喂养3个月，比较5组小鼠喂养后15 d、1个月、2个月及3个月的行为学变化。结果爬杆实验中从小球上下来的计分：时间、干预方法在实验分值上存在统计学差异(P<0.05),B1组、B2组、B3组与B4组相比，存在统计学差异(P<0.05);爬杆实验中小鼠爬完杆子上半部的计分：时间、干预方法在实验分值上存在统计学差异(P<0.05),B1组实验分值低于A组和B2组(P<0.05),B2组实验分值高于B4组(P<0.05);爬杆实验中小鼠爬完杆子的下半部的计分：时间、干预方法在实验分值上存在统计学差异(P<0.05),B1、B2、B3、B4组实验分值低于A组(P<0.05),B4组实验分值高于B1组(P<0.05)。悬挂实验计分：时间、干预方法在实验分值上存在统计学差异(P<0.05),B1、B2、B3、B4组实验分值均低于A组(P<0.05),B2、B3、B4组实验分值均高于B1组(P<0.05)。游泳实验计分：干预方法在实验分值上存在统计学差异(P<0.05),时间在实验分值上无统计学差异(P>0.05),B1组实验分值低于A组(P<0.05),B2组实验分值高于B1组(P<0.05)。所有实验结果中B2组与B3组间均不存在统计学差异(P>0.05)。结论骨化三醇、益生菌均可改善PD小鼠的行为学，两者联合应用未显示疗效，且两者间的有效性差异将有待进一步研究。

关键词：
帕金森病
益生菌
神经系统
行为学
骨化三醇
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帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是常见的神经系统进行性退行性疾病，临床表现为运动迟缓、震颤、僵硬等运动症状，及以便秘、嗅觉缺失等为代表的非运动症状。PD的主要病理变化是路易体(Lewy bodies, LBs)和路易神经元突起(Lewy neurites, LNs)的细胞内包涵体的聚集，以及致密部(Substantia nigra pars compacta, SNpc)的黑质多巴胺能(Dopamine, DA)神经元的丢失[1];对PD的进展病程，目前的治疗只能提供暂时的症状缓解，丢失的神经元从病理上无法恢复[2]。近年来，肠道起源已成为PD发病机制的理论，而肠道是维生素D的主要靶组织，其中1α,25-二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3)负责肠上皮的屏障功能和肠道炎症的调节是关键作用。本研究应用骨化三醇与益生菌进行对照研究，观察PD小鼠的行为学变化，从而了解干预效果。

1、材料与方法

1.1实验动物

2021年5月至2021年10月完成试验，选取雄性SPF级健康C57BL/6小鼠45只，鼠龄8周，体重19.0～24.0 mg,均由上海复旦大学药学院实验动物中心提供并饲养[许可证编号：SCXK(沪)2018-0003],温度20～25℃,相对湿度40%～70%,工作照度150～300 Ix,动物照度15～20 Ix, 12 h光照/黑暗交替。

1.2实验试剂

骨化三醇由青岛海尔公司提供；益生菌购自上海信谊药厂有限公司；1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)购于美国Sigma公司。

1.3 PD小鼠制模

实验小鼠给予MPTP腹腔注射，剂量为40 mg·kg-1·d-1,持续5 d,第一批制模第一天注射后次日发现死亡小鼠9只，尸体解剖显示均为肠坏死，查阅文献分析原因考虑为制模过程中腹腔注射过深至肠腔坏死而死亡。随后补充实验动物、规范穿刺方法，同时调整制模注射剂量为30 mg·kg-1·d-1,持续7 d,成功制模PD小鼠40只。正常对照组予生理盐水每只0.1 mL,腹腔注射，每天1次，连续7 d。后期采用Western Blot检测小鼠黑质的α-syn含量验证制模成功。

1.4分组及干预方法

将45只健康C57BL/6小鼠随机分为A组(正常对照，n=5)、B1组(PD模型对照，n=10)、B2组(PD模型益生菌干预，n=10)、B3组(PD模型骨化三醇干预，n=10),B4组(PD模型益生菌联合骨化三醇干预，n=10)。A组、B1组小鼠均0.9%氯化钠溶液1 mL·d-1进行灌胃；B2组小鼠给予益生菌溶液109个·d-1灌胃；B3组小鼠给予骨化三醇25μg·kg-1·d-1进行灌胃；B4组小鼠给予益生菌联合骨化三醇进行灌胃(浓度同前),用法用量分别与B2组、B3组相同；连续喂养3个月；灌胃的时间均在每日上午9:00～10:00;称重1次/2周，并根据体重调整给药量。

1.5行为学观察

各组分别于制模后15 d、1个月、2个月、3个月每组每批每时间段，在预定时点12时、14时、16时进行行为学观察。爬杆实验：将一直径为25 cm的软木球固定于一根长50 cm、粗1 cm的木杆顶端，木杆上缠上纱布以防打滑，然后将被测小鼠放到小球上，并记录小鼠从小球上下来所需要的时间、小鼠爬完杆子的上半部所需要的时间、小鼠爬完杆子下半部所用的时间；然后按以下标准记分：3 s内完成上述某一动作的记3分，6 s内完成的记2分，超过6 s的记1分；最后计算得分情况，并作统计学分析。悬挂实验：将受试小鼠悬挂于一水平电线上，如小鼠用两后爪抓住电线则记3分，如小鼠用一后爪抓住电线则记2分，如果小鼠两后爪均抓不住电线则记1分，最后计算得分情况，并作统计学分析。游泳实验：将受试小鼠放入一个20 cm×30 cm×20 cm规格的水箱中10 min,水温为22～25℃,先让动物在实验箱中自由活动1～2分，以适应环境；将受试小鼠按顺序放入水箱，进入水箱后开始计时，每只小鼠的游泳时间限定为6 min,用秒表记录限定时间内的漂浮时间，记录评分标准如下：在受试时间内能连续不断游泳者记30分，大部分时间游泳(占总受试时间70%～80%)仅偶尔漂浮者记25分，游泳时间占整个受试时间50%～70%记20分，偶尔游泳者(占受试时间30%～50%)记15分，偶尔用后肢游动者(少于受试时间30%)并漂浮在一边记10分，最后计算得分情况，并作统计学分析。

1.6统计学方法

采用SPSS24.0软件处理数据，计量资料以

表示，重复测量数据采用重复测量方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义；组内效应分析，未满足球形度检验时，球形度W值>0.75,则使用HF校正结果；球形度W值<0.75,则使用GG校正结果；组间效应呈现出显著性后，使用事后多重比较研究具体差异。

2、结果

2.1各组小鼠存活情况

A组小鼠全部正常存活至实验结束；B1组小鼠制模成功10只，1只在第73天喂养过程中出现进食减少、消瘦、毛发逐渐脱落而死亡，考虑与PD制模衰老所致，另2只在第90天采血过程中失血过多而死亡；B2组小鼠制模成功10只，其中2只小鼠分别在第40天、第51天灌胃时操作不慎至小鼠窒息而死亡，1只在第90天采血过程中失血过多而死亡；B3组小鼠制模成功10只，其中1只小鼠在第25天灌胃时操作不慎至小鼠窒息而死亡，2只在第90天采血过程中失血过多而死亡；B4组小鼠制模成功10只，其中1只在第90天采血过程中失血过多而死亡。

2.2各组爬杆实验分值情况

2.2.1爬杆实验中从小球上下来的计分

时间、干预方法在实验分值上存在统计学差异(P<0.05),说明各时间点、干预方法的不同都会影响实验分值；时间与干预方法在实验分值上无交互效应；B1组、B2组、B3组与B4组相比，均存在统计学差异(P<0.05)。见表1及图1。

表1各组爬杆实验中小鼠从小球上下来的计分

图1爬杆实验中小鼠从小球上下来的计分

2.2.2爬杆实验中小鼠爬完杆子的上半部的计分

时间、干预方法在实验分值上存在统计学差异(P<0.05),说明各时间点、干预方法的不同都会影响实验分值；时间与干预方法在实验分值上无交互效应；B1组实验分值低于A组和B2组，且实验分值存在统计学差异(P<0.05);B2组实验分值高于B4组，且存在统计学差异(P<0.05)。见表2及图2。

表2各组爬杆实验中小鼠爬完杆子的上半部分的计分

图2爬杆实验中小鼠爬完杆子的上半部的计分

2.2.3爬杆实验中小鼠爬完杆子的下半部的计分

时间、干预方法在实验分值上存在统计学差异(P<0.05),说明各时间点、干预方法的不同都会影响实验分值；时间与干预方法在实验分值上无交互效应；B1、B2、B3、B4组实验分值低于A组，且实验分值存在统计学差异(P<0.05);B4组实验分值高于B1组，且存在统计学差异(P<0.05)。见表3及图3。

表3各组爬杆实验中小鼠爬完杆子的下半部分的计分

图3爬杆实验中小鼠爬完杆子的下半部分的计分

2.3悬挂实验的计分

时间、干预方法在实验分值上存在统计学差异(P<0.05),说明各时间点、干预方法的不同都会影响实验分值；时间与干预方法在实验分值上无交互效应；B1、B2、B3、B4组实验分值均低于A组，且实验分值存在统计学差异(P<0.05);B2、B3、B4组实验分值均高于B1组，且存在统计学差异(P<0.05)。见表4及图4。

表4各组小鼠悬挂实验的计分

图4小鼠悬挂实验的计分

2.4游泳实验的计分

干预方法在实验分值上存在统计学差异(P<0.05),说明干预方法的不同都会影响实验分值；时间在实验分值上无统计学差异(P>0.05);时间与干预方法在实验分值上无交互效应；B1组实验分值低于A组，且实验分值存在统计学差异(P<0.05);B2组实验分值高于B1组，且存在统计学差异(P<0.05)。见表5及图5。

表5各组小鼠游泳实验的计分

图5小鼠游泳实验的计分

3、讨论

PD是中老年中仅次于阿尔茨海默病的第二常见神经系统退行性疾病。世界范围内PD发病率为0.4%～2.0%,目前我国PD患者人数约260万人，预计2030年该数字将达到500万人。但是PD的发病机制不明确、早期诊断方法不够、根治性治疗手段缺乏，因此面临严峻的挑战。传统的观念认为PD仅表现为运动迟缓等运动症状，但是近年来研究发现以便秘、嗅觉缺失为代表的非运动症状在运动症状发生前甚至十年前就出现，并贯穿PD整个发生发展过程，和运动症状一起严重影响患者的生命质量。目前认为PD的发病病理改变是神经元多巴胺变性，其中变性神经元为大量聚集的α-Syn,而这种异常折叠的α-Syn是PD发生发展中的重要病理标志。近年来，微生物群-肠-脑轴(Microbiota-Gut-Brain-Axis, MGBA)被提出，其认为肠道微生物参与PD的发生发展过程，而维生素D和肠道微生物存在相关性。本研究旨在通过建立MPTP致PD小鼠模型，从PD肠源理论出发，对照分析骨化三醇、益生菌对PD小鼠模型行为学的影响，进一步探讨PD的治疗方法。

MPTP致PD小鼠模型是目前常用的PD动物模型之一[3],其在一定程度上再现了PD的主要特征。本研究结果显示，爬杆实验中小鼠爬完杆子的上、下半部分、悬挂实验及游泳实验中B1组小鼠的实验分值均低于A组，且具有统计学差异(P<0.05),与PD的运动迟缓症状相符。本研究结果发现，干预方法与实验分值存在组间主效应，说明骨化三醇、益生菌影响PD小鼠的行为学，除游泳实验，其余各项实验分值均与时间点存在组内效应，具有统计学差异(P<0.05),同时第2、3个月节点PD模型组实验分值呈下降趋势，PD小鼠症状呈逐渐加重趋势，与PD的进行性退行性病变的病理生理基本符合[4]。本研究中爬杆实验上半部分的分值、游泳实验的分值结果均提示：B2组的实验分值高于B1组，存在统计学差异(P<0.05),说明益生菌干预可某种程度改善PD小鼠行为学，与其他研究结论[5,6]基本相符。而爬杆实验下半部分中B2组的实验分值高于B1组，但未达到统计学意义，考虑与以下因素有关：本研究的样本量偏少，后期可进一步扩展样本量；益生菌对PD小鼠行为学的改变存在偏差，肠道微生物群(Gut microbiota, GM)的改变对α-Syn聚集存在选择性，从而导致改善症状的程度不同。一些数据表明，α-Syn聚集可能开始于肠道自主神经丛，并向中枢神经系统扩散[7],这可能受到GM的影响[8]。近年来，GM在PD和其他神经退行性疾病发病机制中的作用引起了越来越多的关注。发病机制包括DA合成和代谢的改变、免疫系统失调和炎症以及肠黏膜通透性的改变等[9]。健康的肠道微生物积极调节中枢神经免疫反应，菌群的失调可能导致一种不良的神经炎症状态，从而增加神经退行性疾病的风险[10]。因此，维持健康肠道微生物菌群可能降低PD患病率。有研究[8,9,10,11]评估了移植GM是否导致PD,与无菌小鼠相比，未消灭微生物组的小鼠的大脑中存在更多的α-Syn聚集；进一步将PD患者的粪便样本移植到无菌小鼠中会加剧α-Syn诱导的运动症状。因此，GM成分对大脑中α-Syn聚集具有联合作用。有关PD的研究[12,13,14]表明，与非PD对照组相比，GM存在显著差异。GM组成的变化可能与PD的不同临床表型有关，肠道菌群调节干预，如益生菌和粪便菌群移植，有可能恢复肠道生态失调，减少炎症，调节PD的临床表型[15]。服用含有乳酸杆菌、双歧双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌和发酵乳杆菌的益生菌(活性微生物膳食补充剂)的PD患者，其统一帕金森氏病评分量表(UPDRS)评分总分较安慰剂组显著降低[16],我们前期的行为学变化证实了益生菌对PD行为学的改变，但粪便菌群、病理改变是否有相关的阳性发现，需待后期的研究结果进一步验证。

本研究中爬杆实验下半部分的分值、悬挂实验分值结果均显示，B3组实验分值高于B1组，且存在统计学差异(P<0.05),提示骨化三醇可改善PD小鼠的某些行为学；爬杆实验上半部分的分值结果显示，B2组的实验分值高于B4组，存在统计学差异(P<0.05),仅能提示益生菌的效果好于联合组，但益生菌与骨化三醇之间的优劣性尚无明确证据；同时结果提示两者对PD小鼠行为学的改变仅1或2项，而非全部改变，考虑与以下因素有关：本研究中益生菌及骨化三醇均采取灌胃的方式，而小鼠的消化吸收不均一，后期是否可寻找更科学，误差更小的干预方法，如静脉注射等；PD的致病因素复杂，而非仅单一的表现，需待后期的样本量扩大、粪便菌群检测、病理等进一步研究。肠道菌群失调与炎性反应直接相关，肠道是维生素D的主要靶组织，其中，其活性形式1,25-(OH)2D3负责肠上皮的屏障功能和肠道炎症的调节是关键作用。体外数据表明[17],在维生素D缺乏和维生素D受体基因敲除的动物中，肠道微生物群出现紊乱而导致代谢失调；亦有研究[18]证实，膳食中维生素D和25-(OH)-D3的摄入量与粪球菌和双歧杆菌呈负相关；而肠道微生物群本身也可通过成纤维细胞生长因子影响维生素D的代谢[19]。因此，维生素D对GM具有明显影响。有报道[20]称，维生素D可以通过将M1促炎反应转移到M2抗炎反应来减轻炎症反应，上调抗炎标志物的表达，抑制诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(L-1β)等炎性因子的表达。此外，骨化三醇可通过调节TNF基因转录的机制减弱TNF在小胶质细胞中的表达起到抗炎作用[21]。同时维生素D缺乏和功能不全在PD患者中较常见[22,23],以往人们往往将之归结为PD患者活动能力受限从而减少了日光照射，同时PD患者的胃肠功能降低进一步影响维生素D的吸收。

综上所述，骨化三醇、益生菌均可改善PD小鼠的行为学，但两者间的差异不明确；骨化三醇对于PD小鼠行为学的改善可能源于对肠道微生物的作用，调节肠道炎症反应，通过MGBA抑制α-Syn在中枢神经系统的异常折叠与沉积，从而改善PD相关症状，可以成为PD潜在的治疗方法。

基金资助:上海市浦东新区卫健委面上项目(PW2020A-15､PW2022A-17); 上海市浦东新区卫生系统重点亚专科建设资助项目(PWZY2020-01);

文章来源:刘慧琴,杨娟.骨化三醇与益生菌对帕金森小鼠模型行为学影响的对照研究[J].贵州医药,2024,48(03):345-350.