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妊娠期高血压对子代大鼠肾组织端粒长度的影响

2023-10-08 46 上传者：管理员

摘要：探讨妊娠期高血压对子代大鼠肾组织端粒长度的影响。方法将6只8周龄SD雌性大鼠随机等分为实验组和对照组，实验组大鼠构建高血压模型。分别于术前及术后1个月测量两组雌鼠的鼠尾血压。术后1个月时，选取3只10周龄雄鼠，每只雄鼠均随机与对照组中的1只雌鼠和实验组中的1只雌鼠合笼饲养，待雌鼠生产后，从每只雌鼠的子代中随机选取4只新生大鼠，构成子代实验组和子代对照组，采用实时荧光定量PCR法检测子代大鼠肾组织端粒的相对长度、端粒酶及端粒结合蛋白的相对表达量。结果术后1个月，实验组大鼠血压高于对照组，差异有统计学意义(t=5.266,P<0.05)。实验组与对照组雌鼠子代数量分别为(11.33±2.15)只和(12.67±3.10)只，差异无统计学意义(t=0.859,P>0.05)。与子代对照组比较，子代实验组大鼠肾组织端粒相对长度较短，差异有统计学意义(0.82±0.09 vs.1.04±0.07,t=3.024,P<0.05),肾组织端粒酶逆转录酶相对表达量较高，差异有统计学意义(2.11±0.58 vs.1.01±0.34,t=7.248,P<0.05)。与子代对照组比较，子代实验组端粒重复因子1(TRF1)、端粒重复因子2(TRF2)、端粒保护因子1(POT1)、端粒保护蛋白1(TPP1)表达水平均升高，差异均有统计学意义(均P<0.05),两组TRF1相互作用核蛋白2(TIN2)和阻滞活化蛋白1(RAP1)表达水平比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论亲代雌鼠妊娠期高血压可造成子代大鼠肾组织端粒长度缩短，对肾脏发育造成潜在影响。

关键词：
大鼠
妊娠期高血压
慢性疾病
端粒
肾
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成人慢性疾病是危害人类健康的主要疾病之一，近年来发病率逐年上升。成人疾病的胎儿起源学说认为：若胎儿在宫内发育过程中受到母体因素的不良影响，机体会优先保证重要器官的营养供应，牺牲对肾脏、肝脏等一般器官的保障，以利于短期生存，但此类胎儿出生后会显著增加成年期代谢疾病的患病风险[1]。妊娠期高血压是妊娠期特有的常见疾病，以高血压和蛋白尿为主要临床特征，是引起孕产妇和围生儿发病和死亡的一个重要原因。越来越多的研究[2,3]提示：妊娠期高血压会导致胎儿的组织器官在功能上发生不可逆的损伤，增加出生后对各种慢性病的易感性。妊娠期高血压可使子代肾脏组织中11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅱ表达降低，影响糖皮质激素的代谢平衡，增加代谢综合征等疾病的发生风险。目前，妊娠期高血压对子代肾脏的影响及潜在机制尚未阐明，本研究基于端粒及其相关调控蛋白的表达变化，从一个较新的角度探索妊娠期高血压的潜在危害，为成人疾病的胎儿源性机制探索提供参考。

1、材料与方法

1.1材料来源

研究时间2021年10月—2022年9月，选取8周龄SD雌性大鼠6只，10周龄SD雄性大鼠3只，由军事医学科学院动物实验中心提供。试剂和仪器包括基因组DNA和总RNA共提试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、实时荧光定量试剂盒(北京康维世纪生物科技有限公司),高速低温离心机(美国Thermo Scientific公司),PCR仪(StepOne,美国ABI公司)。

1.2方法

1.2.1实验分组及样本采集

将6只8周龄SD大鼠随机等分为实验组和对照组。实验组大鼠行双侧肾动脉后支结扎，术后饲喂含8%氯化钠的饲料以构建高血压模型，对照组饲喂普通饲料。术后1个月时，选取3只10周龄雄鼠，每只雄鼠均随机与对照组中的1只雌鼠和实验组中的1只雌鼠合笼饲养，待雌鼠生产后，从每只雌鼠的子代中随机选取3只新生大鼠，构成子代实验组和子代对照组。

1.2.2鼠尾血压检测

应用鼠尾血压检测仪，分别于术前及术后1个月测量两组雌鼠的鼠尾血压，测量时先连续测量3次，待大鼠适应测量操作，无明显挣扎后再行血压测量并记录数值。

1.2.3端粒相对长度及端粒酶相对表达量测定

按照试剂盒说明书提取子代大鼠肾组织DNA和总RNA。通过PrimerBank设计端粒、端粒酶逆转录酶(TERT)、端粒重复因子1(TRF1)、端粒重复因子2(TRF2)、端粒保护因子1(POT1)、端粒保护蛋白1(TPP1)、TRF1相互作用核蛋白2(TIN2)及阻滞活化蛋白1(RAP1)的引物序列。设计端粒引物，每个样品设置2个重复孔。扩增基因采取两步法：95℃,15 min预变性；95℃,10 s,然后60℃,32 s进行38个循环。应用2-ΔΔCt法计算各基因的相对长度[4]。各基因引物序列：①端粒：上游引物5'-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3',下游引物5'-TGGGAGTGGGAGTGGGATGTGGGAGTGGGAGTTTTTGG-3';②TERT:上游引物5'-AGTGGTGAACTTCCCTGTGG-3',下游引物5'-AGAACAGTCAGAACGCCAAC-3';③TRF1:上游引物5'-TACCAAACTCAAGCCCCATC-3',下游引物5'-AAAGCTACACTAAACGACG-3';④TRF2:上游引物5'-AGAAGAAAGCGAGTGGGTGA-3',下游引物5'-GTCTCGGTGTCCTGAGTGTT-3';⑤POT1:上游引物5'-CAGATTCGGCAGTCACTCAA-3',下游引物5'-GTAACACACGGCAAAACTTC-3';⑥TPP1:上游引物5'-CAGTGACCACCCAGGACTTT-3',下游引物5'-TGTTCCTCACCCTGGACAAC-3';⑦TIN2:上游引物5'-AAAACCAGCATCCCACAGTC-3',下游引物5'-GTCCTTGTGTCCGGATGGTA-3';⑧RAP1:上游引物5'-GTGAGCCTTGGTTGGAATGT-3',下游引物5'-TTTGATAGGGTAAGGGGTCC-3';⑨GAPDH:上游引物5'-TACACTGAGGACCAGGTTG-3',下游引物5'-ATACCGCTGTCGTTGTCCC-3'。

1.3统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件进行分析，结果以均数±标准差(x¯±s)表示，计量资料应用两独立样本t检验进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组血压比较

术前，实验组与对照组大鼠血压分别为(121.56±20.45)mm Hg和(118.67±16.35)mm Hg,差异无统计学意义(t=0.259,P>0.05);术后1个月，实验组与对照组大鼠血压分别为(167.11±38.17)mm Hg和(125.11±17.03)mm Hg,实验组大鼠血压高于对照组，差异有统计学意义(t=5.266,P<0.05)。

2.2两组子代数量比较

实验组与对照组雌鼠子代数量分别为(11.33±2.15)只和(12.67±3.10)只，差异无统计学意义(t=0.859,P>0.05)。

2.3两组子代肾组织端粒相对长度及TERT相对表达量比较

与子代对照组比较，子代实验组大鼠肾组织端粒相对长度较短，差异有统计学意义(0.82±0.09 vs.1.04±0.07,t=3.024,P<0.05),肾组织TERT相对表达量较高，差异有统计学意义(2.11±0.58 vs.1.01±0.34,t=7.248,P<0.05)。

2.4两组各端粒结合蛋白基因相对表达量比较

见表1。

表1两组各端粒结合蛋白基因相对表达量比较(x¯±s)

与子代对照组比较，子代实验组TRF1、TRF2、POT1、TPP1表达水平均升高，差异均有统计学意义(均P<0.05),两组TIN2和RAP1表达水平比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。

3、讨论

妊娠期高血压发病率约为10%,对孕妇自身及胎儿均会造成不良影响，也是导致婴儿不良预后的重要原因之一，已有研究[5,6]证实妊娠期高血压会增加子代心脑血管疾病、神经系统疾病、内分泌系统疾病的发生风险，但其对子代肾脏发育会造成何种影响以及作用机制尚不明确，探索妊娠期高血压对子代肾脏的影响与机制对于阐明及预防其对子代的远期不良影响具有重要意义。端粒存在于真核细胞的染色体末端，作为一段非编码重复序列，可随着细胞增殖与分化而逐渐缩短，当端粒缩短到一定程度时则会造成细胞水肿及凋亡[7]。端粒长度缩短既是细胞老化的产物，又是细胞老化的原因，在动物肾组织样本中，端粒长度缩短与肾功能下降相关。本研究基于端粒的损伤与修复理论，探讨了亲代高血压对子代肾脏端粒长度和端粒相关蛋白表达的潜在影响，为制定妊娠期高血压的预防策略提供参考。

本研究结果发现：妊娠期高血压对大鼠子代数量无显著影响，但妊娠期高血压雌鼠的子代肾组织端粒长度显著缩短，可能是由以下3个方面导致：①高血压可导致机体炎症反应，刘恒等[8]研究发现在高血压脑小血管病患者的血清中，IL-6、IL-1β及TNF-α等炎症细胞因子水平均显著升高，且其水平越高，神经损伤程度越严重。张蕊等[9]研究发现妊娠期高血压患者血清炎症细胞因子的表达水平异常升高。长时间炎症反应可诱导TERT基因从细胞核向细胞浆转位，使端粒酶丧失活性，导致端粒进行性缩短[10]。同时，炎症细胞因子可直接作用于端粒DNA,造成二硫键断裂，促进端粒缩短[11]。②高血压可导致氧化应激，提高机体活性氧簇。动物模型中可见实验诱导的高血压大鼠体内氧化应激水平升高与高血压存在相关性[12]。赵巧棉等[13]研究发现：高血压妊娠患者体内δ-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性被抑制，造成氧化应激水平增加，机体抗氧化能力下降，氧化应激在一定程度上可以引起端粒长度缩短[14]。③妊娠期高血压导致子代在子宫内呈现慢性缺氧状态，造成端粒DNA损伤[15]。

本研究结果显示：实验组TERT、TRF1、TRF2、POT1、TPP1基因表达显著升高，可能是由于端粒长度变化一直处于动态调节过程中，当端粒受到外界不良刺激而发生损伤及缩短后，细胞内端粒酶和端粒结合蛋白的表达代偿性升高，在一定程度上对端粒进行修复。端粒酶是一种能够催化延长端粒末端的核糖核酸蛋白酶，主要由RNA和蛋白质构成，含引物特异识别位点，能以自身RNA为模板，合成端粒DNA并加到染色体末端，使端粒延长[16]。同时，哺乳动物体细胞含有6种端粒结合蛋白，分别是TRF1、TRF2、POT1、TPP1、TIN2、RAP1,他们可通过特异性连接在端粒末端形成六聚体(shelterin复合体),发挥端粒的调控作用[17]。这6种蛋白各自有其独特作用，因此shelterin复合体在结构和功能上具备高度的可塑性，故其同样可以发挥多样化的端粒功能调控作用[18]。TRF1是最早被发现的端粒结合蛋白，在哺乳动物体内高度保守，其SANT/Myb-type结构域是介导与端粒双链DNA结合的基础结构[19]。TRF2是一种蛋白结构与TRF1类似的端粒结合蛋白，在序列上更保守，主要负责招募Mrell修复蛋白和RAP1蛋白聚集到端粒处，防止端粒3'末端丢失和染色体末端融合[20]。研究[21]发现当在细胞中去除TRF2蛋白，或表达部分结构域缺失的TRF2蛋白时，同样可见染色体末端发生融合，端粒DNA大片段缺失。POT1是6种蛋白中唯一特异性结合端粒单链DNA的蛋白，在进化中呈现高度异质性。POT1主要通过与其他端粒结合蛋白结合后共同发挥作用来影响端粒长度，如可与TRF2结合共同促进T-loop形成以稳定端粒结构，还可与TPP1形成复合体，促进端粒与端粒酶结合[22]。TPP1是在寻找与TIN2相互作用的蛋白时发现的一种端粒结合蛋白。曾被命名为TINT1、PTOP1、PIP1。TPP1不仅可以与POT1的羧基端结合形成异二聚体，增强POT1与端粒的结合能力，而且可以与端粒酶相互作用，调节端粒酶活性，从而发挥维持端粒完整性和端粒长度的作用[23]。同时，TPP1还可以通过结合TIN2而与TRF1和TRF2相联系，稳定shelterin复合体结构。研究[24]证实：TPP1在shelterin复合体的形成过程中发挥关键作用，TPP1低表达可能会阻碍shelterin复合体形成，TPP1表达缺失可引起ATM/p53通路激活，导致端粒功能异常，导致染色体不稳定。

综上所述，本研究通过动物模型，发现亲代雌鼠妊娠期高血压可造成子代大鼠肾组织端粒长度缩短，从而对肾脏发育造成潜在影响，为疾病预防的作用靶点提供了参考。

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基金资助:国家重点研发计划项目(2017YFC1307602);