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SREBP1调节EGFR/AKT/ERK通路对食管癌迁移、侵袭及增殖作用

2024-12-13 98 上传者：管理员

摘要：目的探讨甾醇调节元件结合蛋白(SREBP)1在食管癌迁移及侵袭过程中的作用，并初步探索其相关机制。方法首先对4对食管癌组织及癌旁组织进行SREBP1免疫组化染色及Western印迹检测；Western印迹检测人正常食管上皮细胞系(HEEC细胞)相比与食管癌细胞系(TE-1、ECA-109、KYSE-410、KYSE-5200、KYSE-150细胞)中SREBP1表达；划痕实验检测敲低表达SREBP1食管癌细胞系迁移能力的改变；Transwell实验及3D球形细胞侵袭实验检测敲低表达SREBP1食管癌细胞系侵袭能力的改变；Western印迹分析敲低表达SREBP1食管癌细胞中表皮生长因子受体(EGFR)/蛋白激酶B(AKT)/细胞外调节激酶(ERK)通路的活化程度；成瘤实验验证敲低表达SREBP1食管癌细胞的增殖能力。结果与癌旁组织及HEEC细胞相比，食管癌组织及食管癌细胞系中SREBP1表达水平显著增加(P<0.001);敲低表达SREBP1后食管癌细胞系迁移及侵袭能力显著下降(P<0.001);敲低表达SREBP1可显著抑制食管癌细胞中EGFR/AKT/ERK通路激活(P<0.001);敲低表达SREBP1食管癌细胞的成瘤体积显著减小(P<0.001)。结论 SREBP1通过调节EGFR/AKT/ERK通路参与食管癌迁移、侵袭及增殖。

关键词：
甾醇调节元件结合蛋白(SREBP)1
细胞外调节激酶(ERK)
蛋白激酶B(Akt)
表皮生长因子受体(EGFR)
食管癌
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食管癌是一种极具侵袭性的恶性肿瘤，发病率位于恶性肿瘤第九位，死亡率位于第六位，且其发病率正逐年增加[1,2]。腌制蔬菜、烟草和酒精是导致食管癌发病率增加的最常见的因素[1,3]。早期食管癌的治疗策略是以手术为主，可以改善患者预后的作用，然而大多数患者确诊时已是疾病晚期，虽然随着医学的进步，化疗和放疗等治疗手段的疗效不断改善，但食管癌患者的5年生存率仅为20%左右[1]。因此，研究食管癌转移的调控机制至关重要。高代谢是癌症的主要特征之一[4],其中以脂质代谢为主，并且针对脂肪生成和脂质合成来治疗癌症的研究越来越受到重视[5,6]。甾醇调节元件结合蛋白(SREBP)是调节细胞脂肪生成和脂质稳态的主要转录因子，由SREBP1和SREBP2组成，SREBP1具有选择性剪接，主要调节脂肪酸和三酰甘油的合成，而SREBP2主要控制胆固醇基因的表达。既往研究表明，利用SREBP靶向脂肪生成是治疗癌症的一种有前途的策略[7],例如抑制SREBP可增加非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的敏感性[8];SREBP抑制剂法他汀可以增加多西他赛在前列腺癌中的抗癌疗效[9];此外，SREBP上调与一些实体瘤(如肝细胞癌[10]、胰腺癌[11]和结直肠癌[12]等)的疾病进展和恶性转化密切相关。然而，SREBP在食管癌中生物学功能仍不确定。本研究旨在确定SREBP在食管癌迁移、侵袭中的作用。

1、材料与方法

1.1食管癌组织及细胞系

收集2021年3月至2022年2月承德市中心医院诊治的4例患者食管癌组织及癌旁组织，入组患者均已签署知情同意书，并且本研究已获得伦理委员会批准。人正常食管上皮细胞系(HEEC细胞)及食管癌细胞系(TE-1、ECA-109、KYSE-410、KYSE-5200、KYSE-150细胞)均购自上海誉驰生物科技有限公司。

1.2免疫组织化学染色

对入组患者的食管癌组织、癌旁组织及小鼠体内成瘤组织(承德市中心医院实验动物中心提供)进行切片，切片于室温下与10%牛血清白蛋白(BSA,含0.3%tritonX-100)孵育1 h。加入一抗SREBP1(1∶1 000)、磷酸化(p)-表皮生长因子受体(EGFR)2(1∶500,赛默飞，美国),4℃下孵育过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，加入二抗，随后室温下避光孵育2 h。再次PBS洗涤，加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液，最后利用光学显微镜观察并采集图像。

1.3 Western印迹实验

既往研究表明，表皮生长因子受体(EGFR)、蛋白激酶(AKT)和细胞外调节激酶(ERK)通路促进食管癌迁移、侵袭和转移[13]。首先对样本中蛋白质浓度进行测定，随后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜、封闭。加入SREBP1(1∶1 000)、EGFR2(1∶500)、p-EGFR2(1∶500)、AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、ERK1/2(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶1 000,赛默飞，美国)及GAPDH抗体(碧云天，上海，1∶1 000),室温下孵育2 h。加入二抗(1∶1 000)孵育1 h,最后利用电化学发光(ECL)系统(Biorad,美国)检测蛋白质条带。

1.4转染实验

将含有两个靶向SREBP1的shRNA序列的质粒进行转染。目标序列为：SREBP1-shRNA1:5′-ATCGTGAGGACACAATTGACA-3′及SREBP1-shRNA2:5′-TCACAGATTACGCAAGAAGTTC-T-3′。使用磷酸钙转染方案，将shRNA质粒转染到ECA-109及KYSE-150细胞中。转染48 h后收集病毒上清液并过滤，用嘌呤霉素筛选稳定的细胞系。

1.5划痕实验

将细胞以高密度接种于培养板上并使其黏附，过夜，用微量枪头在细胞生长的中央区域划线以去除中央部分细胞，并在24 h后观察细胞迁移程度，在0及24 h后使用倒置显微镜观察细胞并采集图像。

1.6 Transwell实验

将20 000个细胞接种于24孔小室的上部(涂覆基质胶)。24 h后用棉签轻轻除去小室表面的细胞。置于冷甲醇中固定，加入DAPI溶液对培养皿表面的细胞进行染色，置于显微镜下观察并采集图像。

1.7成瘤实验

C57BL/6雌性小鼠(7周龄，北京维通利华实验动物中心),随机分为两组(每组5只),分别在左前肢腋窝皮下接种3组AGS肿瘤细胞(HOXC4-shRNA1、HOXC4-shRNA2、Con-shRNA,上海誉驰生物科技有限公司)。每2～3 d观察并测量肿瘤生长情况，肿瘤长径(a)及短径(b),观察至第8周，待成瘤后解剖小鼠并取得肿瘤组织进行免疫组化检测，肿瘤体积按如下公式计算：体积(mm3)=a×b2/2。

1.8苏木素-伊红(HE)染色

首先将小鼠体内成瘤组织进行常规的石蜡包埋，进行切片、脱蜡、水化，随后对组织切片进行苏木素染色、分化与反蓝，然后进行伊红染色与脱水，封片后在显微镜下观察并采集图像。

1.9统计学方法

采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析、成对Tukey检验。

2、结果

2.1 SREBP1在食管癌组织中及细胞系中表达增加

与癌旁组织[(100.0±11.72)%]相比，食管癌组织中SREBP1表达水平显著增加[(647.39±59.13)%;t=18.161,P<0.001]。Western印迹检测，与癌旁组织[(100.00±5.29)%]相比，食管癌组织中SREBP1表达水平显著增加[(687.39±90.83)%;t=12.912,P<0.001]。与人正常食管上皮细胞系(HEEC细胞，100.00%±41.48%)相比，食管癌细胞系(TE-1、ECA-109、KYSE-410、KYSE-5200、KYSE-150细胞)中SREBP1的表达水平显著增加(578.03%±42.90%、693.11%±54.32%、818.24%±69.36%、603.29%±59.25%、850.29%±50.37%;t=17.769,22.047,26.700,18.708,27.889,均P<0.001)。见图1。

图1 SREBP1在食管癌组织中及细胞系中表达增加

2.2敲低表达SREBP1可抑制食管癌细胞的迁移及侵袭能力

与Con-shRNA组比较，SREBP1-shRNA1组和SREBP1-shRNA2组ECA-109及KYSE-150细胞SREBP1蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图2、表1。与Con-shRNA组相比，SREBP1-shRNA1及SREBP1-shRNA2组ECA-109及KYSE-150细胞的迁移能力均显著下降(图3、表2)。Transwell实验显示，与Con-shRNA组相比，SREBP1-shRNA1及SREBP1-shRNA2组ECA-109及KYSE-150细胞的侵袭能力均显著下降(表2、图4)。3D球形细胞侵袭实验同样显示，与Con-shRNA组相比，SREBP1-shRNA1及SREBP1-shRNA2组ECA-109及KYSE-150细胞球体其侵袭性突起数量显著减少(P<0.001)、结构完整性差(表2、图5)。

2.3敲低表达SREBP1可抑制食管癌细胞中EGFR/AKT/ERK通路的激活

SREBP1下调显著抑制了EGFR2、AKT和ERK1/2磷酸化(P<0.001)。见表3、图6。表明敲低SREBP1表达可抑制EGFR/AKT/ERK通路的激活。

图2利用转染技术在食管癌细胞系(ECA-109、KYSE-150)中成功敲低表达SREBP1

1～3:Con-shRNA组、SREBP1-shRNA1组、SREBP1-shRNA2组；图6同

表1各组细胞中SREBP1表达水平

图3各组划痕实验(×200)

表2各组细胞迁移、侵袭能力比较

图4 Transwell实验检测各组侵袭能力(结晶紫染色，×100)

图5各组3D球形细胞侵袭实验(结晶紫染色，×200)

表3各组细胞中p-EGFR2/EGFR2、p-AKT/AKT、p-ERK1/2表达水平比较

2.4敲低表达SREBP1可在体内抑制食管癌细胞增殖

与Con-shRNA组相比，SREBP1-shRNA组肿瘤组织体积显著减小(P<0.001)。见图7、表4。同时对肿瘤组织中p-EGFR2进行免疫组化分析，结果显示，与Con-shRNA组[(100.00±12.69)%]相比，SREBP1-shRNA组p-EGFR2表达水平显著降低[(27.51±6.32)%;t=11.434,P<0.001]。见图8。

图6敲低表达SREBP1可抑制食管癌细胞中EGFR/AKT/ERK通路的激活

图7各组细胞体内成瘤

表4各组细胞体内成瘤体积

图8两组肿瘤组织p-EGFR2免疫组化(DAPI染色，×200)

3、讨论

食管癌的转移和侵袭仍然是该疾病治疗中的主要障碍之一。随着代谢组学的发展，越来越多参与肿瘤代谢的基因被发现和研究，其中SREBP1、PKM2及GLUT1等被报道能够影响恶性肿瘤的基本生物学功能，例如调控细胞周期、细胞增殖和细胞迁移能力[14]。研究表明，SREBP1可调控某些类型恶性肿瘤的进展，如肝细胞癌[10]、胰腺癌[11]和结直肠癌[12]等。本研究通过对食管癌组织及其细胞系中SREBP1的表达水平进行分析，结果显示SREBP1在食管癌组织及食管癌细胞系中表达显著上调。

本研究进一步显示，敲低SREBP1表达后食管癌细胞的迁移及侵袭能力受到明显抑制。EGFR2是EGFRs家族成员之一，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关[15]。ERK可将信号从表面受体传导至细胞核，参与包括恶性肿瘤细胞在内的多种细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的癌变等多种生物学反应[16]。同样AKT在细胞存活和凋亡中也起到重要作用[17]。既往研究表明，EGFR、AKT和ERK通路均可促进包括食管癌在内的多种恶性肿瘤的迁移、侵袭和转移[18]。基于这一证据，我们推测SREBP1可能通过调控EGFR/ERK/AKT通路的活性进而影响食管癌细胞的侵袭和迁移作用。本研究结果证实了这一假设，SREBP1的下调抑制了EGFR2、AKT和ERK1/2的磷酸化，抑制通路的活化，表明敲低SREBP1表达可抑制EGFR/AKT/ERK通路的激活进而抑制食管癌的肿瘤生物学活性。

在本研究中，体内实验结果显示敲低表达SREBP1可抑制食管癌细胞增殖，肿瘤体积明显缩小，并且敲低表达SREBP1的肿瘤组织中p-EGFR2表达水平显著下降。该研究结果进一步说明SREBP1可调控食管癌细胞增殖，并且降低SREBP1的表达可抑制食管癌细胞增殖，降低食管癌的恶性肿瘤生物学行为。

参考文献:

7闵雪洁,赵丽,赵小平.SREBP在肿瘤中的研究进展[J].上海交通大学学报(医学版),2016;36(8):1256-8.

基金资助:河北省医学科学课题计划(20200387);

文章来源:玄小玉,玄景丽,娄丽华.SREBP1调节EGFR/AKT/ERK通路对食管癌迁移､侵袭及增殖的作用[J].中国老年学杂志,2024,44(23):5763-5768.