首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 食管癌论文 > MMP-14调控YB-1蛋白对食管癌细胞活性经典凋亡信号通路影响

MMP-14调控YB-1蛋白对食管癌细胞活性经典凋亡信号通路影响

2024-12-13 61 上传者：管理员

摘要：目的探究基质金属蛋白酶(MMP)-14通过调控Y盒结合蛋白(YB)-1对食管癌细胞活性及经典凋亡信号通路的影响。方法将EC109细胞分为5组，blank组(EC109细胞未转染任何质粒正常培养);后将MMP-14干扰RNA质粒和阴性对照分别转染后EC109细胞中，设为si-MMP-14组和si-NC组。将YB-1干扰质粒和阴性对照质粒转至EC109细胞中，设为sh-YB-1组和sh-NC组。qRT-聚合酶链反应(PCR)法检测细胞中MMP-14和YB-1表达；噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力；Transwell小室法检测细胞侵袭能力；流式细胞仪检测细胞凋亡能力；Western印迹法检测细胞中β-链蛋白(catenin)、c-myc蛋白表达。结果 MMP-14和YB-1在食管癌细胞中均高表达。和blank组相比，si-MMP-14组细胞中MMP-14和YB-1、β-catenin、c-myc蛋白表达、增殖能力和侵袭细胞数目均显著降低，细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。blank组和si-NC组以上指标差异无统计学意义(P>0.05)。和sh-NC组相比，sh-YB-1组食管癌细胞侵袭能力及细胞中β-catenin、c-myc蛋白表达显著降低、凋亡率显著升高(P<0.05)。结论沉默MMP-14可通过降低YB-1表达调控食管癌细胞活性，抑制食管癌细胞增殖和侵袭，促进凋亡，同时对经典凋亡信号通路Wnt/β-catenin信号通路的激活有抑制作用。

关键词：
Wnt/β-catenin信号通路
Y盒结合蛋白(YB)-1
侵袭
凋亡
基质金属蛋白酶(MMP)-14
增殖
食管癌
加入收藏

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，不良饮食习惯、遗传因素及感染人乳头瘤病毒均可增加其发病率，食管癌细胞侵袭性较强，早期临床不显著，患者5年内生存率仅为30%,预后较差[1,2]。对于早期食管癌患者，手术是主要的治疗方法，可以切除肿瘤，达到治疗的目的。而放疗及化疗也可为患者带来益处。但手术治疗无法应用于晚期患者，放化疗不耐受也一定程度限制了其应用。食管癌的发生发展过程中涉及多个基因，基质金属蛋白酶(MMPs)是一类高度保守的锌离子依赖的蛋白内切酶类，可参与肿瘤细胞的生长、侵袭及迁移[3]。MPP-14是MMPs家族成员之一，能够降解多种细胞外基质成分，如胶原蛋白、纤维连接蛋白等，为肿瘤细胞的侵袭和转移创造条件[4]。另外，MPP-14可以激活MMP-2等其他MMP,增强肿瘤细胞对周围组织的破坏能力[5]。研究表明，在食管癌中MMP-14表达升高，常与浸润剂转移相关，并可作为评估预后的重要指标[6]。多功能脊椎动物Y盒结合蛋白(YB)-1是一种冷休克蛋白，具有多个功能结构域。YB-1可以结合到特定的DNA序列上，调节基因的转录，参与调控许多与细胞增殖、凋亡、耐药等相关的基因表达。在细胞质中，YB-1可以与信使RNA(mRNA)结合，调节蛋白质的翻译过程，并促进某些癌基因的翻译，从而促进肿瘤细胞的生长和存活[7,8]。肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌及胶质瘤等中存在YB-1过表达，且与患者预后不良相关[9]。但YB-1在食管癌中的作用机制尚不清楚。本研究旨在探究MMP-14通过调控YB-1蛋白对食管癌细胞活性及经典凋亡信号通路的影响。

1、材料与方法

1.1细胞系

人食管癌细胞株EC109(中国科学院上海细胞库)。

1.2试剂和仪器

RPMI1640培养基、DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(武汉普诺赛生命科技有限公司);MMP-14抗体、YB-1抗体(北京义翘神州科技股份有限公司);MMP-14干扰质粒(si-MMP-14)和阴性对照质粒(si-NC),YB-1干扰质粒(sh-YB-1)和阴性对照质粒(sh-NC,上海创翼生物科技有限公司);低温高速离心机(山东鑫贝西科学仪器有限公司);荧光倒置显微镜(上海辛卯科学仪器有限公司)。

1.3细胞培养

将人食管癌细胞株EC109置于显微镜下观察有无污染，放入37℃、5%CO2饱和湿度下培养，24 h后弃去培养体后加入含有1%双抗的10%的胎牛血清中培养，培养条件同上。显微镜下观察MG-63细胞生长至80%～90%时进行传代，75%乙醇消毒，弃去旧的培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，加入0.25%胰蛋白酶消化，生长至90%时终止消化反应，脱壁后，放入15 ml的离心管中1 000 r/min, 5 min后，弃去上清液放入培养基中2～3 d传代。

1.4细胞分组和转染

将培养好的EC109细胞接种于6孔板中，采用LipofectamineTM2000试剂盒进行转染。将EC109细胞分为5组，blank组(EC109细胞未转染任何质粒正常培养);后将MMP-14干扰RNA质粒和阴性对照分别转染进EC109细胞中，设为si-MMP-14组和si-NC组。将YB-1干扰质粒和阴性对照质粒转至EC109细胞中，设为sh-YB-1组和sh-NC组。以上5组细胞均继续培养24 h。

1.5 qRT-聚合酶链反应(PCR)检测细胞中MMP-14和YB-1表达

取各组EC109细胞，消化后加入Trizol裂解液裂解，提取细胞中总RNA,逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。MMP-14上游引物5′-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3′,下游5′-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3′;YB-1上游引物5′-GGACAAGAAGGTCATCGCAA-3′,下游5′-TTCGGGAGCACTCTCTCCGAT-3′;GAPDH上游引物5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′,下游5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′。反体系条件为：42℃作用60 min, 72℃作用5 min, 4℃终点。每个细胞设置6个复孔，以β-actin为内参，反应条件为95℃预作用3 min, 95℃作用5 s, 58℃退火，40个循环。用2-△△CT法分析MMP-14和YB-1的表达量。

1.6噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力

EC109细胞移入6孔板中，两者共同培养24、48、72 h吸去原培养液，每个浓度2个复孔，细胞浓度2.5×104个/ml,均加入5 mg/ml的MTT溶液20μl,培养24、48及72 h后，然后吸弃培养液，再在每个孔中加入50μl二甲基亚砜(DMSO),摇匀后放入490 nm波长下检测光密度(OD)值，取3次平均值。

1.7 Transwell小室法检测细胞侵袭能力

将适量的基质胶(100μl)均匀涂抹在Transwell小室的上室底部，将小室放置在37℃培养箱中，使其固化。取各组EC109细胞，将待测细胞以适当密度(106个/ml)悬浮在无血清培养基中。将细胞悬液加入Transwell的上室中(每个小室加500μl)。在下室添加完整培养基，使其与上室的液面平齐，然后将小室放入培养箱中，通常培养24 h,将小室取出，PBS洗涤，随后用4%多聚甲醛固定细胞10～15 min。用0.1%结晶紫染色10～30 min。洗去多余染料，用PBS彻底洗涤，显微镜下观察小室底部的细胞，记录侵袭细胞数量。

1.8流式细胞术检测细胞凋亡能力

将密度为2×105个/ml的各组EC109细胞悬液接种96孔板中，细胞增殖到铺满底面积70%,经2%牛血清白蛋白消化，PBS冲洗置于离心机4 000 r/min离心10 min,收集细胞加入300μl的1×结合缓冲液与5μl的膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(AnnexinⅤ-FITC)混匀，标记，最后加入5μl碘化丙啶(PI),流式细胞仪检测。

1.9 Western印迹检测细胞中β-链蛋白(catenin)、c-myc蛋白表达

取各组EC109细胞，将各组细胞调整为3×105个/ml密度，接种细胞于6孔培养板内，收集贴壁生长的细胞用胰酶消化得到细胞样品，用放射免疫沉淀(RIPA)裂解细胞样品，置于离心管中离心(12 000 r/min)10 min,取其上清液测定蛋白含量。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺进行电泳分离，后将其转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室温封闭2 h,加入1抗(1∶200),4℃孵育过夜，Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)洗涤沪加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000),室温孵育1 h。避光环境下将显影液加入PVDF膜，60 s,采用Image-lab图像分析条带灰度值。

1.10统计学分析

采用Graphpad priam8.0软件进行单因素方差分析和t检验。

2、结果

2.1沉默MMP-14表达对食管癌细胞中MMP-14和YB-1表达的影响

MMP-14和YB-1在食管癌细胞中均高表达。blank组和si-NC组细胞中MMP-14和YB-1表达比较无显著差异(P>0.05)。和blank组相比，si-MMP-14组细胞中MMP-14和YB-1表达均明显降低(P<0.05),见表1。

表1各组MMP-14和YB-1表达、细胞侵袭数目和凋亡率、β-catenin、c-myc蛋白表达比较

2.2沉默MMP-14表达对食管癌细胞中β-catenin、c-myc蛋白表达影响

blank组和si-NC组β-catenin、c-myc蛋白表达均无显著差异(P>0.05);和blank组相比，si-MMP-14组β-catenin、c-myc蛋白表达显著降低(P<0.05),见表1,图1。

2.3沉默MMP-14表达对食管癌细胞侵袭、凋亡能力的影响

blank组和si-NC组细胞侵袭能力、凋亡率均统计学无差异(P>0.05);和blank组相比，si-MMP-14组细胞侵袭能力明显降低，凋亡率明显增加(P<0.05),见表1、图2、图3。

2.4沉默YB-1表达对食管癌细胞侵袭、凋亡能力的影响

与sh-NC组相比，sh-YB-1组食管癌细胞侵袭能力显著降低，凋亡率显著升高(P<0.05),见图2、图3、表2。

2.5沉默YB-1表达对食管癌细胞中β-catenin、c-myc蛋白表达影响

和sh-NC组相比，sh-YB-1组β-catenin、c-myc蛋白表达显著降低(P<0.05),见图1、表2。

图1 Western印迹检测各组β-catenin、c-myc蛋白表达

图2各组细胞侵袭(结晶紫染色，×200)

图3各组细胞凋亡率

表2各组细胞侵袭数目和凋亡率及β-catenin、c-myc蛋白表达比较

3、讨论

中国是食管癌的高发地区，具有发展快、预后差的特点，严重威胁患者的生命安全[10]。目前，恶性肿瘤患者预后不良和死亡率高的主要原因是肿瘤组织的浸润和转移，也是当前恶性肿瘤治疗需要解决的问题。细胞基底膜和细胞外基质(ECM)在肿瘤侵袭过程中相互作用，共同为肿瘤细胞的侵袭和转移提供条件。肿瘤细胞通过分泌蛋白酶降解基底膜和ECM,突破物理屏障，获得附着位点，激活信号传导通路，调节细胞行为，影响肿瘤微环境，从而实现侵袭和转移[11,12]。MMPs是一类跨膜蛋白水解酶，能够穿过细胞基底膜并几乎降解ECM的所有蛋白成分，促进肿瘤细胞的侵袭[13]。MMP-14是MMPs家族的主要成员之一，可以通过调节上皮间质转化(EMT)相关的转录因子和信号通路，促进癌细胞的侵袭及抗凋亡[14]。本实验结果发现，干扰MMP-14的表达能抑制食管癌细胞的增殖和侵袭，促进细胞凋亡。张洋洋等[15]研究证实，沉默MMP-14的表达可抑制食管癌细胞侵袭，其作用机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因survivin的表达水平。Wnt/β-catenin信号通路介导多种生物学过程，例如细胞增殖、转移分化等，对骨质疏松、肿瘤等多种人类疾病有重要意义[16]。Wnt信号通路在胚胎发育和组织稳态维持中起着关键作用。在经典的Wnt/β-catenin信号通路中，Wnt蛋白与细胞表面受体结合，抑制β-catenin的降解，导致β-catenin在细胞质中积累并进入细胞核，与转录因子结合，调节靶基因的表达。在食管癌的发生过程中，Wnt/β-catenin信号通路常常异常激活。这种异常激活可能是由于Wnt蛋白的过表达、受体突变或β-catenin降解机制的失调引起的。激活的Wnt/β-catenin信号通路可以促进食管上皮细胞的增殖和存活，抑制细胞凋亡，从而增加食管癌的发生风险[17]。研究发现，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，可促进细胞的迁移增殖，进而导致肿瘤的发生[18]。研究证实，食管癌中Wnt/β-catenin信号通路被异常激活，进而促进肿瘤发生发展[19]。张凤霞等[20]研究证实，β-catenin、细胞周期蛋白(cyclin)D1和c-myc蛋白在食管癌细胞中高表达，和本研究结果一致。

YB-1可以结合到细胞周期相关基因的启动子区域，促进其转录。YB-1可以上调cyclinD1、周期蛋白依赖激酶(CDK)4等基因的表达，加速细胞周期进程，促进食管癌细胞的增殖。YB-1能够与生长因子受体结合，增强生长因子信号传导。YB-1可以促进表皮生长因子受体的活化，激活下游的磷脂酰激醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，从而刺激食管癌细胞的增殖。癌症基因组图谱(TGGA)数据库显示YB-1蛋白在食管癌细胞中存在扩增现象。本研究结果发现，沉默YB-1表达同样有抑制食管癌细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡作用；降低细胞中β-catenin、c-myc蛋白表达；YB-1蛋白可促进食管癌细胞增殖、侵袭迁移、克隆形成等细胞恶性表型。

参考文献:

5吐尔逊江·艾力,曹国磊,陈慧芳,等.mi R-9和MMP-14在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[J].临床肿瘤学杂志,2021;26(6):554-8.

6吴旭辉,吴功志,彭丛兄,等.食管鳞状细胞癌中基质金属蛋白酶-14和组织蛋白酶D的表达及对预后判断价值的研究[J].中国临床药理学与治疗学,2012;17(12):1388-91.

10程遥,李少民,党诚学,等.葡萄糖转运蛋白1影响食管癌细胞对2-脱氧葡萄糖敏感性的研究[J].世界临床药物,2020;41(4):253-60.

11周静静,顾云,张龙,等.长链非编码RNA-GK3P在食管癌中的表达及其对癌细胞生物学功能的影响[J].环境与职业医学,2021;38(7):701-8.

12尹一峰,胡启辉,杜毅超,等.细胞外基质在肝细胞性肝癌发生发展过程中的作用[J].中国普通外科杂志,2021;30(1):91-7.

13王亚豪,刘洪洲,刘苗苗.阿帕替尼辅助治疗晚期肺癌患者的临床疗效及其对血清基质金属蛋白酶9,自然杀伤细胞的影响[J].癌症进展,2021;19(21):2199-202.

文章来源:彭钦,潘桂华,刘化科,等.MMP-14通过调控YB-1蛋白对食管癌细胞活性及经典凋亡信号通路的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(23):5836-5839.