食管癌是常见的上消化道恶性肿瘤之一,其发病率和病死率均位居全球前十[1]｡食管癌包括鳞状细胞癌(ESCC)和腺癌两种病理组织学亚型,其中ESCC约占90%,是最主要的组织学亚型｡ESCC经常发生在食道的中上部,在东亚国家,特别在中国是最常见的组织学亚型,存在散发和家族聚集两种发病情况[2]｡尽管对于ESCC的治疗,在手术切除､放疗和化疗方面都取得了显著进展,但患者的预后仍不令人满意[3]｡目前,仍然缺乏有效的ESCC靶向治疗药物｡环状RNA(circRNA)是一类新发现的共价闭合RNA分子,不包含5′帽和3′末端聚(a)尾,曾被认为是剪接错误的副产物｡有研究表明,circRNA在转录和转录后水平上调节基因表达方面发挥着关键作用[4]｡异常表达的circRNA与肿瘤发生发展密切相关,可以充当癌基因及抑癌基因发挥重要作用[5-6]｡circRPPH1又称为circRNA-001846,是新近发现的circRNA之一,目前circRPPH1在乳腺癌､胃癌和非小细胞肺癌等常见恶性肿瘤中被报道为促癌基因,可促进肿瘤的恶性生物学行为,包括增殖､侵袭和转移等能力,具有作为肿瘤治疗分子靶点的潜在能力[7-9]｡但是circRPPH1在ESCC中的表达情况及发挥的作用未知,本研究对此进行了分析｡现报道如下｡

1、资料与方法

1.1一般资料

收集2015年1月至2018年2月本院72例ESCC患者的癌组织及癌旁组织｡纳入标准:(1)行食管切除术,术后病理证实为原发ESCC;(2)手术前未接受放､化疗或靶向等治疗;(3)临床病理资料完整;(4)具备规范的患者术后随访资料｡排除标准:(1)发生远处转移;(2)同时患有其他恶性肿瘤｡患者或家属签署知情同意书｡本研究收集标本遵循《赫尔辛基宣言》,并由本院伦理委员会审核通过｡

1.2仪器与试剂

人正常食管鳞状上皮细胞系和ESCC细胞系KYSE450､Eca109､TE-10､EC-1均购自美国ATCC细胞库;DMEM培养基､胰酶､circRP-PH1敲减质粒和circRPPH1过表达质粒和BCA蛋白浓度检测试剂盒均购自美国Thermo公司;胎牛血清购自澳大利亚Ausbian®公司;Trizol试剂购自上海爱必信生物科技有限公司;RNA提取试剂盒购自苏州先达基因科技有限公司;实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)试剂盒购自德国QIAGEN公司;Transwell小室购自美国Coring公司;CCK8试剂盒购自上海圣尔生物科技有限公司;苏木素染色液购自南京景泰医疗有限公司;RIPA裂解液购自北京金克隆生物技术;ECL超敏发光液购自北京普利莱基因技术有限公司;PVDF膜购自美国Millipore公司;p38､p-p38和GAPDH抗体购自英国Abcam公司｡

1.3方法

1.3.1qPCR检测circRPPH1表达

待检测组织经液氮冻存后研磨成粉末,加入TRIzol试剂裂解并溶解组织｡根据RNA提取试剂盒说明书获得总RNA,并检测RNA的纯度,获得其浓度｡依据qPCR试剂盒说明书配制反应体系,其中circRPPH1正向引物5′-TTGGGAAGGTCTGAGACTAGGG-3′,反向引物5′-CCACTGATGAGCTTCCCTCC-3′;GAPDH正向引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,反向引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′｡并根据设置的反应条件于PCR仪上进行qPCR,获得每个样品的Ct值,采用2-ΔΔCt法计算组织标本中circRPPH1的相对表达水平,以GAPDH为内参｡

1.3.2随访

以打电话或者门诊､住院复诊的方式对手术后患者进行5年随访,包括疾病进展和生存情况,随访时间为手术后开始,每半年随访1次,直至患者死亡或随访时间截止｡总生存期(OS)被定义为患者从手术到死亡或最后1次随访的时间｡

1.3.3细胞培养

ESCC细胞系KYSE450､Eca109､TE-10､EC-1和人正常食管鳞状上皮细胞系均采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养,即细胞从液氮中取出,立即复苏后去除冻存液,重悬至37℃培养基中,放置在37℃细胞培养箱中培养,并且含有5%的CO2和饱和湿度｡

1.3.4细胞转染

Eca109和TE-10细胞分别以每孔1×105个接种至6孔板内,TE-10细胞分为oe-NC组和oe-circRPPH1组,Eca109细胞分为sh-NC组和sh-circRPPH1组｡oe-NC组TE-10细胞转染过表达对照质粒,oe-circRPPH1组TE-10细胞转染过表达circRPPH1质粒,sh-NC组Eca109细胞转染敲减对照质粒,sh-circRPPH1组Eca109细胞转染敲减cir-cRPPH1质粒,放置在细胞培养箱中培养｡转染48h后,采用qPCR检测circRPPH1在各组细胞中的表达｡

1.3.5CCK8检测细胞增殖能力

各组细胞以每孔2000个接种至96孔板中,放置在细胞孵育箱中培养｡并分别在培养的0､24､48和72h时更换100μL的新鲜培养基,加入10μL的CCK8检测试剂,混匀后于细胞孵育箱中继续培养2h｡放入酶标仪内检测细胞在490nm处的吸光度(A)值,每组细胞设置6个平行重复孔,每组细胞A值为6个平行重复孔的平均A值｡

1.3.6Transwell试验检测细胞转移能力

24孔板中的Transwell小室膜中加入100μL无血清培养基重悬的1×106个各组细胞,并在小室膜下加入500μL含有10%胎牛血清的细胞培养基｡培养12h后,Transwell小室膜在PBS中洗3次后,甲醇中固定10min､苏木素染色20min后,用刀片将Transwell小室膜切割后,采用二甲苯及中性树胶将小室膜固定在载玻片上,并封片｡在显微镜下计数5个视野内细胞的穿膜数目,并取平均数作为每组细胞穿膜数目｡

1.3.7Western-blot检测p38MAPK信号通路主要蛋白表达

采用胰酶细胞消化收集细胞,并采用PBS清洗后,加入100μL蛋白裂解液,于超声仪中裂解细胞,低温高速离心30min,获得清亮的蛋白裂解液｡

蛋白煮沸变性后加至电泳凝胶中进行电泳,经过电泳转膜后,于膜内加入待检测蛋白p38和p-p38的一抗稀释液在4℃下孵育过夜,p38和p-p38一抗稀释浓度均为1∶500,加入二抗稀释液室温中孵育1h,二抗稀释浓度为1∶8000｡采用ECL发光试剂盒显示蛋白条带及ImageJ软件分析蛋白条带灰度值｡

1.4统计学处理

采用SPSS17.0软件进行数据处理及统计分析,采用graphpad软件绘制统计图｡符合正态分布的计量资料以x±s表示,组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析;计数资料以频数或百分率表示,组间比较采用χ2检验｡采用Kaplan-Meier法分析circRPPH1表达对ESCC患者生存预后的影响｡P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1circRPPH1在ESCC癌组织及癌旁组织中的表达

ESCC癌组织中circRPPH1表达水平为(2.86±0.83),癌旁组织中circRPPH1表达水平为(1.03±0.57),ESCC癌组织中circRPPH1表达水平高于癌旁组织(t=10.332,P<0.001)｡

2.2circRPPH1表达水平与ESCC患者临床病理特征关系的分析

不同性别､年龄､肿瘤分化程度和T分期的ESCC患者癌组织中circRPPH1表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05),有脉管癌栓､有淋巴结转移和TNM分期Ⅲ~Ⅳ期ESCC患者癌组织中circRPPH1表达水平高于无脉管癌栓､无淋巴结转移和TNM分期Ⅰ~Ⅱ期ESCC患者(P<0.05)｡见表1｡

表1circRPPH1表达水平与ESCC患者临床病理特征的关系

2.3circRPPH1表达对ESCC患者生存预后的影响

72例ESCC患者均完成随访,其中死亡38例,存活34例｡以circRPPH1在ESCC癌组织中的中位表达水平(2.86)为界,分为circRPPH1低表达组(43例)和circRPPH1高表达组(29例)｡circRPPH1高表达组5年生存率为39.53%(17/43),circRPPH1低表达组5年生存率为58.62%(17/29),circRPPH1高表达组5年生存率低于circRPPH1低表达组(χ2=4.461,P=0.035)｡见图1｡

图1circRPPH1表达对ESCC患者生存预后的影响

2.4ESCC细胞系中circRPPH1的表达水平

ESCC细胞系KYSE450､Eca109､TE-10､EC-1中circRP-PH1表达水平分别为(5.83±0.47)､(6.95±0.42)､(1.84±0.05)､(2.79±0.67),在人正常食管鳞状上皮细胞系中的表达水平为(1.01±0.05)｡与人正常食管鳞状上皮细胞系相比,ESCC细胞系KYSE450､Eca109､TE-10､EC-1中circRPPH1表达水平增加(t=3.066~17.663,P<0.05),其中在TE-10细胞中表达水平最低,在Eca109细胞中表达水平最高｡

2.5circRPPH1敲减质粒及过表达质粒转染效果

oe-NC组､oe-circRPPH1组TE-10细胞中circRP-PH1表达水平分别为(1.00±0.03)､(5.43±0.67),与oe-NC组相比,oe-circRPPH1组TE-10细胞中cir-cRPPH1表达水平增加(t=11.441,P<0.001)｡sh-NC组､sh-circRPPH1组Eca109细胞中circRPPH1表达水平分别为(0.99±0.05)､(0.37±0.04),与sh-NC组相比,sh-circRPPH1组Eca109细胞中circRP-PH1表达水平降低(t=19.476,P<0.001),见图2｡

图2circRPPH1过表达质粒和敲减质粒转染效果

2.6circRPPH1对ESCC细胞增殖能力的影响与oe-NC组相比,oe-circRPPH1组细胞增殖能力增强(P<0.05),与sh-NC组相比,sh-circRPPH1组细胞增殖能力降低(P<0.05)｡见表2｡

2.7circRPPH1对ESCC细胞转移能力的影响

oe-NC组和oe-circRPPH1组TE-10细胞穿膜数目分别为(69.67±7.15)个和(105.33±9.68)个,与oe-NC组相比,oe-circRPPH1组TE-10细胞转移能力增加(t=5.132,P=0.007)｡sh-NC组和sh-circRPPH1组Eca109细胞穿膜数目分别为(63.67±6.59)个和(46.67±5.46)个,与sh-NC组相比,sh-circRPPH1组Eca109细胞转移能力降低(t=3.441,P=0.026),见图3｡

2.8Western-blot检测各组ESCC细胞中p38MAPK信号通路

主要蛋白的变化与sh-NC组相比,sh-circRPPH1组Eca109细胞中p38MAPK信号通路主要蛋白p38蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),p-p38蛋白表达水平降低(P<0.05)｡与oe-NC组相比,oe-circRPPH1组TE-101细胞中p38蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),p-p38蛋白表达水平增加(P<0.05)｡见表3｡

表2CCK8检测各组细胞A值

图3过表达circRPPH1和敲减circRPPH1的表达对ESCC细胞转移能力的影响

表3circRPPH1对p38MAPK信号通路的影响

3、讨论

ESCC早期缺乏明显的临床症状和有效的筛查策略,ESCC患者通常在发现时已伴有淋巴结转移,而被确诊为晚期,全身化疗和放疗是晚期癌症的主要治疗方法,预后较差,晚期癌症患者的5年生存率通常低于20%,在一些国家,晚期癌症患者的5年生存率甚至低至5%[3]｡肿瘤激活和转移是一个多步骤的复杂过程,涉及各种重要基因和信号通路的活化,ESCC的发病机制涉及多种可改变的风险因素(如饮酒､吸烟､食用滚烫的食物和腌制食品､室内空气污染和水源污染等)和遗传变异(遗传和表观遗传变化)等,目前对其发病机制尚未完全阐明[10]｡因此,研究ESCC恶性进展中发挥关键作用的分子,对了解ESCC的进展和转移以寻找ESCC治疗靶点具有重要的临床意义｡

circRNA是一种新型内源性非编码RNA(ncRNA),与线性RNA不同,circRNA具有共价闭合的连续环结构,且具有显著的细胞外稳定性和进化保守性[4]｡circRNA已成为恶性肿瘤研究领域中的重要角色,可能成为肿瘤诊断､预后潜在生物标志物和治疗靶点[11]｡随着高通量测序技术的发展,ESCC中异常表达的circRNA越来越多,例如circCYP24A1在ESCC中表达上调,主要通过与NF-κB通路激活剂PKM2相互作用,增加趋化因子配体5(CCL5)的分泌,促进肿瘤细胞增殖､迁移､侵袭和克隆形成的能力[6]｡circFAM120B在ESCC患者癌组织和血浆中表达下调,其表达下调与ESCC患者总生存率低相关｡circFAM120B通过微小RNA(miR)-661的吸附恢复肿瘤抑制因子PPM1L的表达进而抑制ESCC癌细胞的增殖､转移和侵袭能力｡circFAM120B是ES-CC的一种有前途的生物标志物和候选治疗靶点[12]｡而circRPPH1是由ZHAO等[13]在2020年首次报道,目前相关研究虽然较少,但有研究结果显示,cir-cRPPH1在肿瘤中发挥促癌作用,其在乳腺癌组织中表达增加,可促进肿瘤细胞增殖､迁移､侵袭和糖酵解,并诱导癌细胞凋亡｡但是circRPPH1在ESCC中的表达情况鲜见有报道,本研究结果显示,circRPPH1在ESCC癌组织中表达上调,且circRPPH1表达上调与ESCC患者脉管癌栓､淋巴结转移及TNM分期Ⅲ~Ⅳ期相关,表明在ESCC中circRPPH1同样可能发挥促癌作用,并且circRPPH1高表达的ESCC患者5年生存率较低,表明circRPPH1可作为评估ESCC患者预后不良的生物标志物｡

为进一步分析circRPPH1在ESCC发生发展中的作用,本研究通过敲减circRPPH1表达和circRP-PH1过表达试验均发现circRPPH1可促进ESCC癌细胞的增殖和转移能力｡在非小细胞肺癌中circRP-PH1通过激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路(PI3K/AKT)和非受体酪氨酸激酶/信号转导子和转录激活子(JAK2/STAT3)信号轴来加速癌细胞的生长和转移,从而促进肿瘤恶性进展[9]｡在胆囊癌中circRPPH1可以作为miR-296-5P的海绵来上调STAT3,并与FUS相互作用以促进磷酸化(p)-STAT3核转运,从而促进胆囊癌细胞的增殖､迁移和侵袭能力[14]｡circRPPH1可能通过激活肿瘤相关信号通路促进ESCC恶性进展｡丝裂原活化蛋白激酶P38(p38MAPK)是参与MAPKs的4种主要信号通路之一,在细胞外刺激下,激活的p38MAPKTyr和Tyr双位点同时磷酸化,激活的p38MAPK将信号转导到Nuclei,启动相关靶基因的转录,促进细胞表型转化[15]｡有研究表明,p38MAPK在ESCC中呈高表达,与肿瘤的发生和发展有关[16]｡CHENG等[17]发现,miR-125b可以靶向p38MAPK抑制ESCC癌细胞生长和转移能力｡本研究结果显示,circRPPH1激活ESCC中p38MAPK信号通路,提示circRPPH1可能通过激活p38MAPK信号通路促进ESCC癌细胞的增殖和转移能力｡目前研究发现circRNA的作用机制主要是通过竞争性内源性RNA(ceRNA)竞争性结合miR,靶向miR调节mRNA来发挥作用[7,14],但本研究未对此进行深入研究,在后续试验中会对此进行探讨｡

综上所述,circRPPH1在ESCC癌组织中表达上调,与患者脉管癌栓､淋巴结转移､TNM分期Ⅲ~Ⅳ期和预后差相关,circRPPH1促进ESCC癌细胞增殖和转移能力,可能是通过激活p38MAPK信号通路发挥作用｡本研究主要不足是未深入分析circRPPH1在ESCC中促进癌细胞增殖和转移能力的确切作用机制和直接的作用靶点,未来的研究将进一步深入分析｡

参考文献:

[10]杨欢,孙宛怡,王建炳,等.中国食管癌病因学､筛查及早期诊断研究进展[J].肿瘤防治研究,2022,49(3):169-175.

[11]苏琦.非编码RNA在消化系统肿瘤中的作用[J].中南医学科学杂志,2022,50(6):781-784.

[16]吴艳.p38MAPK抑制剂对食管鳞癌细胞增殖的影响及分子机制研究[D].苏州:苏州大学,2022.

基金资助:内蒙古自治区科学计划项目(202002108);

文章来源:梅宁卓,李智军,马宇霞,等.circRPPH1通过p38MAPK信号通路对食管鳞状细胞癌细胞增殖和转移的影响[J].国际检验医学杂志,2025,46(07):879-884.