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食管癌细胞血管生成拟态的形态学及机制研究

2021-05-31 175 上传者：管理员

摘要：目的通过体外培养对食管癌细胞血管生成拟态进行形态学研究，并探讨其可能的分子机制。方法体外培养食管癌细胞Eca-109、Kyse-150、TE-10，观察其是否具有形成血管生成拟态的能力。体外培养Eca-109细胞，分别用0、10、20、30μmol/L的通路抑制剂LY294002处理细胞24h，应用MTT法检测LY294002对细胞增殖及形成血管生成拟态能力的影响。Westernblotting法检测LY294002对Eca-109细胞Akt及pAkt蛋白表达的影响。结果食管癌细胞在体外培养下能够形成血管生成拟态，Eca-109细胞血管生成拟态形成数量最多，与Kyse-150细胞相比，差异有统计学意义（P<0.05）。LY294002对食管癌Eca-109细胞增殖有抑制作用，且呈剂量依赖性。Eca-109细胞加入不同浓度的LY294002处理24h后，血管生成拟态形成能力有下降的趋势，浓度为30μmol/L时，抑制作用最为明显（P<0.05）。Westernblotting结果显示，不同浓度LY294002对食管癌Eca-109细胞Akt蛋白表达水平的影响无统计学差异（F=3.78,P>0.05），对食管癌Eca-109细胞pAkt蛋白表达水平的影响有统计学差异（F=33.23,P<0.05）。结论食管癌细胞在体外培养条件下均具有形成血管生成拟态的能力，不同来源的食管癌细胞，血管生成拟态形成能力不同。PI3K/Akt通路参与食管癌细胞血管生成拟态的形成。

关键词：
信号通路
磷脂酰肌醇3激酶
蛋白激酶B
血管生成拟态
食管癌
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血管生成拟态（VM）的发现是对传统肿瘤血管生成理论的补充[1],VM不同于内皮细胞依赖的肿瘤血管结构，是高侵袭性肿瘤细胞为满足自身的血供，通过自身变形和细胞外基质重塑而形成的一种类似血管样的通道。VM丰富了人们对肿瘤微环境的认识，同时也向内皮细胞依赖的肿瘤血管模式提出了挑战。目前在黑色素瘤[2]、肝癌[3]、胃癌[4]等恶性肿瘤中均发现了VM，仅针对肿瘤血管生成的治疗可能并不能完全阻断肿瘤血供，VM的存在维持了肿瘤的营养供应导致其持续生长[5]。因此，针对恶性肿瘤中经典的血管生成以外的血供形式设计治疗策略就显得尤为重要。本研究选用食管癌细胞Eca-109、Kyse-150和TE-10为研究对象，通过体外培养的方式对食管癌细胞VM进行形态学研究，并探讨其可能的分子机制。

1、材料与方法

1.1主要材料与试剂

人食管癌细胞Eca-109、Kyse-150和TE-10均购自深圳市拓普生物科技有限公司，Akt、pAkt单克隆抗体和LY294002均购自美国CellSignaling公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养

Eca-109、Kyse-150和TE-10细胞完全培养基为RPMI1640+10%胎牛血清（FBS)+1%双抗，细胞传代及收集。培养皿中已增殖至85%～90%的Eca-109、Kyse-150、TE-10细胞，去旧培养基，加入2mL磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤1次。加入1.5mL0.25%胰酶消化细胞，倒置显微镜下观察，待细胞收缩变亮即将脱落时，立刻加入3mL细胞对应完全培养基终止消化。倾斜将细胞吹下，并将细胞悬液转入15mL离心管中，1000r/min，离心5min。完全弃上清液，加入3mL细胞对应完全培养基重悬细胞沉淀，以1∶3传代。

1.2.2VM形成实验

24孔板放于-20℃预冷，将Matrigel基质胶置于冰上溶解，按每孔300μL加至预冷的24孔板中，铺匀，置于37℃2h，待其凝固。胰酶消化4种细胞，以每孔5×105个接种于加有Matrigel基质胶的24孔板中，每孔1mL，每组设置3个复孔。37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，显微镜下观察VM形成情况。

1.2.3MTT增殖实验

取对数生长期的Eca-109细胞，以每孔5×103个接种于96孔培养板中，37℃、5%CO2条件下培养24h。设置3组浓度梯度，每组3个复孔。所用检测的药物浓度为10、20、30μmol/L。对照组加入相同体积的培养液。37℃、5%CO2饱和条件下培养24h，每孔加入20μL的MTT溶液，避光孵育4h，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）溶液150μL，置水平摇床上15min，采用酶联免疫检测仪在490nm波长下测各孔吸光度OD值。细胞生长抑制率（%）=100-平均相对吸光率。

1.2.4Westernblotting检测

取适量组织加入RI-PA裂解液（加蛋白酶抑制剂1∶100+PMSF1∶100）冰上操作，裂解30min，样品备用。BCA蛋白浓度测定试剂盒检测总蛋白量。调整蛋白浓度为5μg/μL，上样体积为2μL，蛋白量每孔10μg。100℃水浴变性5min。冷却后上样。80V跑胶25min,160V跑胶50min。200mA电转2h。5%脱脂牛奶TBST封闭2h。稀释一抗，用5%BSA的TBST稀释，4℃孵育过夜。TBST洗涤5次，每次5min。按照1∶10000稀释二抗，用5%脱脂牛奶的TBST稀释，室温2h。TBST洗涤5次，每次5min。按1∶1配制发光液，覆盖在膜表面，显色2min后曝光。图像采集分析。

1.2.5LY294002对食管癌Eca-109细胞VM的影响

选用Eca-109细胞，将已增殖至85%～90%的该细胞加入RPMI1640+1%双抗培养基，对其饥饿24h。将24孔板放于-20℃预冷，将Matrigel基质胶置于冰上溶解，按每孔300μL加至预冷的24孔板中，铺匀，置于37℃2h，待其凝固。细胞饥饿24h后，收获细胞，用含LY294002的培养基中（浓度分别为0、10、20、30μmol/L）悬浮细胞。以每孔5×105个接种于加有Matrigel基质胶的24孔板中，每孔1mL，每组设置3个复孔，并培养4h。4h后换液，继续培养20h。培养24h后，显微镜下观察VM形成情况。

1.3统计学处理

应用软件ImageJ软件对VM图片进行分析，每组按至少3张图片进行VM计数。应用GraphPadPrism8.0进行统计学分析并作图。定量资料以表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1食管癌细胞VM的形态学观察

食管癌细胞在Matrigel基质胶上能模拟血管内皮细胞的特性并相互连接，形成典型的血管网状样结构，呈单个环状或多个环状相连的网格状结构，Eca-109、Kyse-150和TE-10细胞均有VM形成，但Kyse-150形成VM的细胞结构松散，较前2种细胞不明显。应用ImageJ软件进行VM计数，Eca-109、Kyse-150和TE-10细胞形成VM数量分别为（48.00±9.85）、（25.33±6.65）、（32.33±2.52）个，Eca-109细胞VM形成能力相对最高，与Kyse-150细胞相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.2通路抑制剂LY294002对Eca-109细胞增殖的影响

不同浓度（10、20、30μmol/L）的LY294002作用于食管癌Eca-109细胞24h后，Eca-109细胞的增殖抑制率分别为8.91%、17.48%、28.14%。可见，PI3K/Akt通路抑制剂LY294002对食管癌Eca-109细胞具有抑制作用，并呈剂量依赖性。

2.3通路抑制剂LY294002对Eca-109细胞VM形成的影响

Eca-109细胞培养加入LY294002，从VM形态上观察，3个不同浓度（10、20、30μmol/L)LY294002处理Eca-109细胞24h后，VM原有的环状或网格状结构均不同程度地出现断裂。见图2。进行VM计数，空白对照组（PBS）及LY294002浓度为10、20、30μmol/L组，分别为（50.33±6.81）、（42.00±2.65）、（38.67±2.89）、（30.33±5.13）个，随浓度的增加，VM形成有下降的趋势。30μmol/L组抑制作用最为明显，与空白对照组相比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

图1食管癌细胞VM形态学观察

图2LY294002对Eca-109细胞VM形成的影响

2.4LY294002对Eca-109细胞Akt及pAkt蛋白表达的影响

用PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002(0、10、20、30μmol/L）干预Eca-109细胞24h后，Westernblotting检测各组细胞中Akt及pAkt蛋白的表达，见图3。Akt的相对蛋白量分别为1.05±0.90、1.03±0.17、0.84±0.11和1.22±0.14。不同浓度LY294002对Akt蛋白水平的影响无统计学差异（F=3.78,P>0.05）。pAkt的相对蛋白量分别为1.03±0.09、0.63±0.02、0.62±0.05和0.69±0.04。不同浓度LY294002对pAkt蛋白水平的影响有统计学差异（F=33.23,P<0.05）。说明LY294002呈浓度依赖性抑制Eca-109细胞中pAkt蛋白表达，表明LY294002干预Eca-109细胞后，PI3K/Akt通路活性被抑制。

图3LY294002干预后食管癌Eca-109细胞Akt和pAkt蛋白的表达水平

3、讨论

随着手术技术的进步和新型抗癌药物、新辅助放化疗及生物治疗的发展，多模式综合治疗使肿瘤患者的预后及生存率得到了极大的提高，但食管癌预后仍较不佳[6,7,8]。与其他恶性肿瘤一样，食管癌在生长过程中需要新生血管提供营养支持，丰富的新生血管也为肿瘤细胞进入血液或淋巴循环进而到达转移部位提供了途径。

VM是由肿瘤细胞直接构成管道壁，其没有内皮细胞的屏障作用，可以为肿瘤的生长提供良好的血液供应，更利于肿瘤细胞的转移[9,10]。本研究发现，食管癌Eca-109、Kyse-150和TE-10细胞均能够形成VM，但其形成VM的能力有所不同，Eca-109细胞形成VM最为明显，Kyse-150形成能力最差。这种形成能力的差异，考虑与食管癌细胞来源不同有关。有研究表明，不同转移潜能的肝癌细胞体外培养形成VM的能力存在差异，高转移潜能的肝癌细胞更易形成VM[11]。Kyse-150细胞来源于接受放疗后的食管癌患者，提示放疗能够从一定程度上抑制肿瘤VM。

PI3K/Akt信号通路广泛存在于人体细胞中，在各种细胞因子、生长因子等刺激因素作用下，激活PI3K,Akt蛋白只有在通路激活后才会被磷酸化为具有活性的pAkt，从而在细胞的增殖、存活及凋亡等方面发挥重要的生物学作用[12,13]。因此，可通过检测pAkt的表达水平来评价PI3K/Akt的活化程度。有研究表明，Akt被干扰后，食管癌细胞增殖速度明显减慢，细胞的迁移力显著下降，并增加细胞凋亡率[14]。本研究发现，PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002干预Eca-109细胞后，pAkt蛋白水平表达显著下降，提示PI3K/Akt通路活性受抑制；同时导致食管癌细胞VM数量下降，这说明PI3K/Akt信号通路参与到食管癌细胞VM的形成。然而，PI3K/Akt信号通路在体内众多组织及细胞正常生理活动中起重要作用，抑制PI3K/Akt活性虽然可抑制食管癌细胞VM，但是其对正常组织生物学行为也不能忽略。

综上所述，食管癌细胞具有生成VM的能力，不同来源的食管癌细胞VM生成能力有所差异。PI3K/Akt通路抑制剂能够抑制Eca-109细胞pAkt蛋白的表达及VM的形成，表明PI3K/Akt通路对食管癌细胞VM有调控作用。

参考文献：

[3]屈波,余飞,盛冠男,等.MIG7调节肝细胞癌中血管生成拟态的形成及其对肝癌转移潜能的影响[J].四川大学学报(医学版),2017,48(3):373-377.

[4]李烨婷,唐有为.人参皂苷Rg3体外通过抑制Wnt/β联蛋白通路阻止胃癌SGC7901细胞血管生成拟态的形[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2019,26(5):518-523.

[5]陈冠男,余飞,盛冠男,等.肿瘤血管生成拟态研究的希望与挑战[J].现代肿瘤医学,2017,25(1):138-141.

[11]刘文斌,许戈良,荚卫东,等.不同转移潜能人肝癌细胞株体外血管生成拟态差异及其相关机制研究[J].中华实验外科杂志,2011,28(8):1303-1305.

[14]张小三,张一明,杨树军,等.微小RNA-150对食管癌细胞增殖､凋亡和PI3K/Akt通路的影响[J].临床肿瘤学杂志,2018,23(11):967-972.

文章来源：徐海涛,苗静,刘帅,贾腾,李娜,张庆广,张连国.食管癌细胞血管生成拟态的形态学及机制研究[J].现代医药卫生,2021(10):1621-1624.

基金：山东省医药卫生科技发展计划项目(2017WS555)