食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是我国高发的恶性肿瘤，放疗是其中晚期的重要治疗手段之一，但部分ESCC患者表现出的放疗抗拒导致其预后较差。肿瘤的放射敏感性既与肿瘤细胞自身相关，也与其所处免疫微环境密切相关。前列腺素E2(prostaglandin E2,PG-E2）可抑制抗肿瘤的免疫功能[1]。环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2）作为合成前列腺素的限速酶，通过促进癌细胞增殖、抑制凋亡导致对放化疗的抗拒，还可诱导免疫抑制[2,3]。有文献报道包括ESCC在内的多种肿瘤组织中COX-2高表达，但ESCC组织中COX-2的表达在放疗后如何变化，以及这种变化对ESCC的免疫微环境有何影响尚不清楚[4]。本项研究观察ESCC患者血清中COX-2、调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）、细胞毒性效应T细胞（effector T cell,Teff）在放疗前后的变化，并检测COX-2蛋白及其mRNA、Treg、Teff在ESCC移植瘤中的表达和浸润情况，研究COX-2在ESCC放疗前后的表达变化规律及其对免疫微环境的影响，从而为利用COX-2作为靶点治疗ESCC提供实验基础和理论依据。

1、材料与方法

1.1材料

兔间变表皮鳞癌细胞（VX2）株购自广州吉尼欧生物公司；新西兰大白兔（3～4个月龄，体质量2～3 kg，雌雄不限，许可证号：SCXK 2015-0004）购自无锡恒泰实验动物养殖有限公司；RPMI1640培养基购自Gibco公司；10%小牛血清购自杭州四季青公司；COX-2 ELISA试剂盒购自晶美公司；CD4-FITC、CD25-PE、CD127-ECD、CD8-ECD、CD3-PC5荧光标记抗体购自法国Immunotech公司；FLOWCHECK试剂、鞘液购自美国Beckman Coulter公司；免疫组化染色所用抗体、染色试剂盒购自武汉博士德公司。鼠抗兔抗CD4、CD25/抗CD3、CD8荧光抗体购自Abcam公司；TRIzol试剂购自Invitro‐gen Biotechnology;One Step RNA PCR kit购自Ta Ka Ra;FACSort流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司；Shimadzu UV-2550紫外分光光度计购自日本Shimadzu Scientific Instruments。

1.2方法

1.2.1 ESCC患者血样采集

收集2018年至2019年在泰州市人民医院接受根治性放疗的ESCC患者56例，采用三维适形放疗或调强放疗技术常规分割剂量，2 Gy/（次·d），总剂量60 Gy/（30次·6周）。在放疗前、放疗15次、放疗30次时分别采集外周静脉血3 ml×2管（含EDTA抗凝），一份血样进行流式检测，另一份静置5 min后室温1 000 g离心30 min，收集上层血清冻存于-70℃冰箱，用于检测血清中COX-2含量。另收集20例健康体检者血样作为对照。本项目获得泰州市人民医院伦理委员会批准，伦理批号：KY201809501。

1.2.2流式细胞术检测血样中Treg和Teff表达

取抗凝血样加入流式上样管，100μl/管，细胞数约为1×106个。每个流式管中加入相应抗体（Treg:CD4-FITC、CD25-PE、CD127-PC5;Teff:CD8-PE、CD3-FITC），涡旋振荡，室温避光15 min后加入1 ml溶血素，涡旋振荡，室温避光10～12 min后加入1 ml PBS或生理盐水，涡旋振荡后300 g离心5 min，弃上清液。加入300～500μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测Treg及Teff占T淋巴细胞总数的比例。

1.2.3 ELISA检测血样中COX-2蛋白含量

取ESCC患者冻存的血清，解冻后加入96孔板，每份血样加3孔，50μl/孔。ELISA试剂盒检测血样中COX-2表达水平。操作过程严格按照ELISA试剂盒说明书进行。酶联分析仪在450 nm处测定光密度值3次，取平均值，参照标准曲线读出血液标本中COX-2蛋白浓度。

1.2.4 ESCC移植瘤的辐射实验

VX2细胞株在1640培养基中培养至80%丰度后收集细胞，调整细胞密度为1×106个/ml，新西兰兔开胸手术暴露食管，注射器抽取0.5 ml细胞悬液接种于食管黏膜下层以诱发ESCC，具体步骤参照文献[5,6]。接种后第3周实验兔接受颈部CT扫描，可见食管肿块后处死实验兔。取新鲜食管肿瘤组织，快速病理切片、HE染色后证实为鳞癌；其余癌组织在无菌生理盐水中剪成1 mm3的小组织块，接种于9只新西兰兔的双后肢内侧皮下以构建移植瘤。荷瘤兔在移植术后3周、移植瘤生长至直径1.5 cm左右时随机分为大分割照射组（10 Gy×2次，第1天、第5天）、常规分割组（2 Gy×10次，5次/周）和不放疗的对照组，每组3只荷瘤兔。放疗参数：兔麻醉后俯卧于加速器治疗床，双下肢外展、固定，采用固定源皮距照射，SSD=100 cm，照射靶区为荷瘤兔的左侧后肢移植瘤，右侧移植瘤在随机时行穿刺、获取组织作为基线标本。在放疗的第14天处死荷瘤兔，取左侧移植瘤组织标本行后续试验。

1.2.5 RT-PCR实验检测移植瘤组织中COX-2的mRNA

TRIzol法提取移植瘤组织中的总RNA，紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，选择260 nm/280 nm吸光度比值为1.8～2.0的RNA样品进行后续RT-PCR试验，实验步骤参照试剂盒说明书。COX-2 mRNA正向引物：5'-ATGTATGAGTGT‐GGGATTTGA-3'，反向引物：5'-TCCAAAATCCCTT‐GAAGTGGG-3′。选择看家基因β-actin作为内参，β-actin正向引物：5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGA‐CAAG-3'，反向引物：5'-AGGAAGGAAGGCTGGAA-GAGTG-3'。上述引物均由Invitrogen Biotechnology合成。PCR反应体系为：95˚C预变性15 min;95˚C变性15 s;60℃退火1 min,70℃延伸20 s，共进行40次循环。采用2-ΔΔCt法（ΔCt=Ct样本-Ct内参）计算样本中COX-2 mRNA相对表达水平。所有试验重复3次，取平均值。

1.2.6免疫组化实验检测移植瘤组织中COX-2表达水平

上述移植瘤组织经甲醛固定、石蜡包埋，4μm厚切片，经微波抗原修复、BSA封闭后行SP法免疫组织化学染色，一抗为鼠抗兔COX-2单克隆抗体，湿盒中孵育过夜，PBS冲洗后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育4 h后PBS冲洗，DAB显色。显微镜下观察显色反应并及时终止反应后封片。每张切片在高倍显微镜下选取5个不同视野拍照，图像经Imageproplus 6.0软件进行半定量分析，得到5个视野的平均光密度值（meanopticaldensity,MOD）代表蛋白表达水平。

1.2.7免疫荧光实验检测移植瘤中T淋巴细胞

上述各组移植瘤组织经甲醛固定、石蜡包埋后切片，微波抗原修复，5%BSA封闭30 min，滴加不同荧光素标记的抗CD4、CD25抗体（检测Treg细胞），湿盒中4℃冰箱孵育过夜。PBS冲洗5 min×5次，滴加DAPI避光孵育2 min，对细胞核进行染色。PBS洗去DAPI后甘油封片防荧光淬灭，在荧光显微镜下观察、拍照。将抗体更换为抗CD3、CD8以检测Teff细胞，重复上述操作。每张切片随机取5个不同视野拍照，计数每个视野中复合显色的细胞数，取5个视野的平均值为该切片中Treg或Teff的数量。

1.3统计学分析

采用SPSS21.0进行统计学分析。计量资料以表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以百分比（%）表示，组间比较采用卡方（χ2）检验，等级资料采用秩和检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 ESCC患者血清COX-2及外周血Teff和Treg细胞在放疗前后的变化

56例ESCC患者血清COX-2的基线水平为（25.56±9.83) ng/ml，高于健康体检者的（18.17±7.56) ng/ml，差异有统计学意义（P=0.001）。在放疗中途（15次时）、放疗后（30次后）血清COX-2表达逐步升高，分别为（32.41±12.2) ng/ml、（41.49±13.02) ng/ml，较基线值有明显差异（P=0.006,P<0.001，图1）。这些ESCC患者放疗前外周血中CD3+CD8+细胞毒性Teff细胞比例为（36.7±11.4）%，在放疗中、放疗后的比例分别为（32.1±10.3）%、（26.5±9.4）%，较基线水平降低，放疗后Teff细胞数量与基线值差异有统计学意义（P=0.070,P=0.003）。放疗前外周血中CD4+CD25+CD127-Treg细胞比例为（20.6±9.5）%，在放疗中、放疗后的比例分别为（27.4±12.3）%、（34.3±18.2）%，较基线水平升高，差异有统计学意义（P=0.030,P<0.001，图2）。

2.2兔ESCC移植瘤组织中COX-2 mRNA在放疗前后的变化

本研究显示，在兔的食管黏膜下接种VX2细胞可诱发食管癌（图3A），病理切片证实为鳞癌（图3B,HE染色，×100）。取食管癌组织接种至其他兔的皮下可形成移植瘤（图3C），移植瘤接受放疗后局部有坏死（图3D）。RT-PCR实验结果显示荷瘤兔在大分割放疗后COX-2 mRNA相对表达量较基线上升不明显（7.4±3.3 vs 3.7±0.9,P=0.130，图3E），而常规分割照射后COX-2 mRNA水平有了显著升高（15.7±7.9 vs 4.5±1.6,P=0.013，图3F）。

2.3兔ESCC移植瘤组织中COX-2蛋白表达在放疗前后的变化

免疫组化结果显示，接受常规分割剂量照射的移植瘤组织中COX-2蛋白较基线有明显升高（图4A,IHC染色，×200），图像分析软件得到的MOD值为0.53±0.24 vs 0.28±0.09（图4C），而接受大分割照射的移植瘤组织中COX-2蛋白较基线无明显变化（图4B,IHC染色，×200),MOD值为0.34±0.19 vs 0.29±0.07（图4D）。

图1 ESCC患者放疗前、中、后血清中COX-2表达水平  

图2 ESCC患者放疗前、中、后外周血中Teff、Treg细胞变化 

图3兔ESCC移植瘤的大体和组织学图像及放疗前后移植瘤组织中COX-2 mRNA表达变化  

2.4兔ESCC移植瘤组织中浸润T淋巴细胞在放疗前后的变化

在接受大分割放疗的第14天，移植瘤组织中CD3+CD8+Teff细胞与基线水平相比稍有增多（图5A),CD4+CD25+Treg细胞与基线水平相似（图5B）。在接受常规分割放疗的第14天，移植瘤组织中Teff细胞明显低于基线水平（图5C），而Treg细胞有所增多（图5D）。

图4移植瘤组织中COX-2蛋白在放疗前后的表达变化（×200) 

图5移植瘤组织中Teff、Treg细胞在放疗前后的浸润情况（免疫荧光染色，×100)  

3、讨论

放疗是治疗ESCC的重要手段之一，放疗引起的生物学效应包括靶细胞DNA损伤、信号转导通路变化、介导炎症反应及肿瘤微环境改变，炎症反应和诱发抑制性免疫微环境可导致癌细胞的放疗抗拒[6]。COX-2是分解花生四烯酸生成内源性PG-E2的限速酶，是一种诱导型酶，在生理状态下不表达或很少表达于脑、肾、妊娠后期胎盘组织，但在细胞受到刺激时会迅速合成，参与细胞增殖和炎症反应。COX-2是诱发炎症反应和影响免疫微环境的一个重要因素，进而影响ESCC患者的放疗疗效和预后。目前尚不清楚放射治疗或放射治疗引起的应答反应如何改变COX-2表达进而影响肿瘤免疫微环境，因此，研究食管癌患者COX-2在放疗后的表达变化以及这种变化对肿瘤免疫微环境的影响具有重要意义。

本研究数据显示，ESCC患者血清中COX-2基线值高于健康人群，这与文献报道的癌组织中COX-2表达高于正常食管黏膜组织相吻合。ESCC患者和荷瘤兔在常规分割剂量放疗后COX-2水平逐渐升高，与其他报告相似[7,8]。常规分割剂量的放疗可导致肿瘤细胞凋亡，诱导粒细胞、MDSCs浸润，引发局部炎症反应，在这种炎症环境下，COX-2/PG-E2被诱导表达[9,10]。而PG-E2可触发一个正反馈循环，通过激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EFGR）进一步促进COX-2表达上调[11]。此外，放疗可损伤射野内血管内皮细胞，导致局部形成乏氧环境，缺氧诱导因子（hypoxia-inducible fac‐tor,HIF）可激活NF-κB/COX-2信号通路，进而上调COX-2表达。但也有报道显示放疗可导致COX-2表达降低[12]。XI等[13]的研究则显示ESCC患者放疗后部分COX-2表达增加，而部分降低。这些研究结果间差异的原因尚不清楚，可能是射线的类型以及检测时间点不同导致。COX-2催化PG-E2表达，导致肿瘤细胞bcl-2表达增加，进而促进细胞增殖、抑制其凋亡，导致辐射抗拒，因此COX-2高表达的患者往往放疗不敏感且预后较差[14]。

本组结果显示，ESCC患者在常规分割放疗后血清COX-2表达升高，同时血清中Treg细胞增多，Teff细胞减少；ESCC荷瘤兔接受常规分割放疗后在移植瘤组织中也观察到类似变化。提示COX-2不仅影响癌细胞本身的辐射敏感性，还可能影响肿瘤免疫微环境。COX-2影响免疫微环境的可能机制包括：①COX-2上调VEGF表达[15,16]。VEGF可增加Treg细胞聚集，活化肿瘤相关巨噬细胞（tumor asso‐ciated macrophages,TAMs），抑制树突状细胞（den‐dritic cells,DCs）成熟，与免疫抑制密切相关，并诱导对放疗的抗拒，使用COX-2抑制剂可下调VEGF的表达并增加放疗敏感性[17,18]。②COX-2可增加Treg细胞的局部浸润。WANG等[19]和FALUYI等[20]报道癌组织内Treg细胞的浸润与COX-2表达水平呈正相关，并与放化疗抗拒和较差的预后相关[21]。詹磊等[22]报道利用塞来昔布抑制COX-2的表达可减少Treg细胞数量。③COX-2可减少CD8+Teff细胞的募集并抑制其活性。COX-2通过促进PGE2和组胺合成，抑制IL-2和IFN-γ表达，抑制了细胞毒性T淋巴细胞的增殖和向肿瘤组织浸润的能力，并削弱Teff的免疫杀伤作用[23]。此外COX-2帮助癌细胞修复辐射引起的亚致死性损伤、减少凋亡，不能有效刺激Th细胞，也就不能活化Teff细胞[24]。④COX-2可增加癌细胞的免疫检查点，主要是PD-1/PD-L1表达上调，进一步抑制CD8+T细胞功能，从而促进肿瘤的免疫逃逸[22,25]。本研究结果显示ESCC患者在常规分割放疗后血清中COX-2表达上调，相应的外周血中Treg细胞比例增加、Teff细胞比例降低。荷瘤兔在接受常规分割剂量照射后血清中COX-2水平升高，相应地移植瘤组织中Treg细胞浸润增多、Teff细胞数量减少，与上述文献报告一致。

本研究结果还显示，荷瘤兔在接受大分割剂量照射（10 Gy×2次）时COX-2表达水平较基线略有升高，但不如常规分割照射组升高明显，可能的原因是大分割剂量照射导致靶细胞免疫原性死亡而非凋亡，促进巨噬细胞吞噬、递呈抗原，而不是诱导炎症反应。此外，大分割剂量照射主要引起靶细胞DNA的直接损伤（direct action,D），而较少通过电离水分子引起自由基导致的间接损伤DNA(indirect action,ID）。文献表明，D/ID高的照射可导致COX-2表达减少[26]。本组免疫荧光实验结果显示，大分割照射后移植瘤局部Teff细胞逐渐增多，放疗后10 d明显增多，提示大分割辐射可诱导细胞毒性Teff浸润，并且是迟发性增多，与既往文献报道相似[27]。

常规分割放疗一方面导致靶区内淋巴细胞的消耗，另一方面诱导COX-2表达升高引起癌组织中Treg浸润增多、细胞毒性Teff浸润减少，导致免疫抑制；而大分割放疗并不增加COX-2表达，相应地也不导致Treg细胞增多[28]。提示可在临床采用常规分割放疗的同时联合抗COX-2治疗（如塞来昔布）以改变免疫微环境，提高放疗敏感性[29]。

参考文献:

[1]范才,李亚星,贺战国,等.兔VX2食管癌模型的建立及生物学特性观察[J].中华肿瘤防治杂志,2011,18(3).:177-179.

基金资助:江苏省卫生健康委面上项目(H2017076);泰州市“311工程”项目(RCPY201813);

文章来源:吴越,刘馨博,卢开进等.COX-2在食管鳞癌放疗前后的表达变化及其对免疫微环境的影响[J].中国免疫学杂志,2023,39(07):1463-1468.