阳离子脂质体是一种带正电荷的脂质体，由于其具有制备简单、生物可降解等优点，作为非病毒载体被应用于基因疗法的研究中[1-9]，例如1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE），常作为一种助磷脂用于脂质类药物的合成[8-12]。常用的阳离子脂质由三部分组成，包括亲水头基、疏水尾基以及两者之间的连接基因[1,8]。通常亲水阳离子头部包括季铵、胺、氨基酸、肽、胍基、杂氮环等[13-14]。阳离子脂质的疏水尾部通常是饱和或不饱和烷烃链，研究发现烷烃链的长度和不饱和度会影响阳离子脂质的载体性能。连接部分在阳离子脂质的整体能力中起着关键作用，结构上具有多种类型，如醚、酯、酰胺等，用于调节阳离子脂质的化学稳定性、生物可降解性、细胞毒性和转染效率等[15-18]。

锍离子是带正电荷的三取代硫化合物，含有锍离子结构的腺苷蛋氨酸广泛存在于动植物中[17]。近年研究人员加大了对锍离子的开发，如在药效改良方面，经过锍修饰的博莱霉素和棘皮霉素的生物活性显著提高[19]。在抑菌剂开发中，含锍的化合物体现出较含氮类抑菌剂更强的抑菌性能[20-23]。在基因载体的应用中，以锍离子为阳离子头部，合成具有较好的转染效果可降解聚合物[24-26]。近年来，锍离子作为基因载体所表现出的能力引起了人们的广泛关注，因为它的正电荷可以与DNA结合，形成合适的纳米粒子并将基因导入细胞。然而，目前锍离子为阳离子头部的阳离子脂质的研究报道较少，对锍类脂质体在基因载体方面的能力和特异性尚不完全清楚，对锍离子的性能与结构之间的关系还有待探索。实验设计并合成一组锍类化合物，其结构具有阳离子脂质的基础特征，含有多样官能团，从而达到功能多样化。探索该组化合物的合成方法及其作为基因载体的功能，为后续锍类化合物的研究提供基础。

1、实验部分

1.1 仪器与试剂

Ascend 600M AVANCEⅢHD型核磁共振仪，德国Bruker公司；Thermo Finnigan型质谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司Universal HoodⅡ型凝胶成像仪，美国Power Pac公司；Universal Power Supply型电泳仪，美国Power Pac公司；Cy5标记试剂盒，美国Mirusbio公司；质粒大提试剂盒，德国Qiagen公司；粒径分析仪，英国Malvern公司；透射电子显微镜，日本JEOL公司；激光共聚焦显微镜，德国Leica公司。

四氟硼酸银，上海阿拉丁公司；溴化乙锭（EB），上海阿拉丁公司；DMEM高糖培养基，北京索莱宝公司；磷酸缓冲盐粉末，上海阿拉丁公司；eGFP质粒，上海赛默飞公司；琼脂糖粉，北京索莱宝公司；MTT粉末，上海阿拉丁公司；胎牛血清，浙江四季青公司。

1.2 实验方法

1.2.1 化合物合成

锍离子脂质化合物的合成如图1所示，以五溴戊酸乙酯（A）、巯基乙醇及n=10、12、14、16的4种溴代烷烃为原料，通过三步操作合成了4个锍类化合物。

具体操作：将巯基乙醇（1 eq）溶解在DMF中，加入过量饱和氢氧化钠溶液，搅拌5 min，冷却至0℃后滴加A(1.2 eq）并搅拌30 min，稳定恢复至室温搅拌2 h，用水淬灭反应后萃取，浓缩，采用硅胶色谱柱分离得到中间产物B(Rf=0.38，甲醇-二氯甲烷1∶20）。将产物B(1 eq）与四种溴代烷烃（n=10、12、14、16)(1.5 eq）溶解于干燥乙腈中，加入四氟硼酸银（1.2 eq),70℃油浴中搅拌24 h，然后冷却至室温，用强碱性氯离子交换树脂交换2 h，浓缩分离，采用硅胶色谱柱分离，二氯甲烷与甲醇混合溶剂为洗脱剂，得到产物C1～C4，化合物用核磁与质谱表征。

图1 锍离子脂质的合成路线

1.2.2 凝胶阻滞实验

质粒gWiz-GFP在DH-5α E.coli扩增，用Qiagen EndoFree Plasmid Kit提取，用Nanodrop测定质粒浓度，用双蒸水稀释至100 ng·μL-1的溶液待用。

将C1～C4用DMSO溶解，分别配置成0.92、4.6、9.2、13.8、18.4、23 nmol·μL-1的溶液备用。取配置好的溶液1μL用蒸馏水稀释至总体积均为6μL的溶液，随后分别滴入3μL的DNA(eGFP质粒，100 ng·μL-1,300 ng的DNA中含有0.92 nmol的P）涡旋震荡10 s后，静置30 min，得到硫磷摩尔比（S/P）为1/1,5/1,10/1,15/1,20/1,25/1的DNA复合物。复合物与1μL上样缓冲液混合后，缓慢加入到0.8%的琼脂糖凝胶的凝胶孔中，溴化乙锭作为核酸染料，在120 V电压下电泳20 min，最终使用凝胶成像仪对DNA在凝胶中的迁移进行分析。

1.2.3 复合物的动态光散射实验及形态学观察

通过凝胶阻滞实验测试，选择能够完全复合DNA的2个化合物C3、C4，将其分别溶于DMSO，配制成2 nmol·μL-1的储备液。分别取化合物储备溶液（1.23、6.15、12.3μL），用双蒸水稀释至32μL，将32μL的DNA(800 ng）滴入化合物溶液中，用移液器轻轻吹打，室温静置20 min，形成S/P为1/1、5/1、10/1的C/DNA复合物。用双蒸水将配制好的复合物溶液稀释至1 mL，通过激光粒度仪（Nano-ZS ZEN）检测复合物颗粒的大小和Zeta电势。用PBS溶液将配制好的复合物溶液稀释，取少量滴至铜网上，自然晾干后滴加2%磷酸钨负染液，再次晾干，使用透射电镜观察形貌。

1.2.4 锍化合物的毒性测试

将能够完全复合DNA的化合物C3、C4分别配制成0.015、0.075、0.15、0.6、4.5、9 nmol·μL-1的DM-SO溶液，备用。选择稳定生长的对数生长期HepG 2细胞，在96孔板中以8 000个/孔的数量接种150μL细胞悬液。在37℃，5%CO2培养箱中培养12 h至细胞贴壁后，将培养液置换成无血清培养液。每孔加入1μL各浓度化合物，空白对照加入1μL DMSO，继续培养24 h后，吸走旧的培养液，每孔加入90μL新的不含血清培养液后，再加入10μL MTT溶液（5 mg·mL-1），继续在培养箱中培养4 h，将孔板中的培养液换成150μL DMSO，将96孔板置于酶标仪中，在波长490 nm下测量吸光度，计算化合物的IC50值，绘制出细胞存活率曲线。

1.2.5 复合物细胞摄取情况检测

按照试剂盒操作步骤用Cy5标记e GFP,-20℃遮光保存备用。将C3、C4溶于DMSO配制成4 nmol·μL-1的溶液，备用。将细胞爬片置于24孔板中，接种500μL，密度为40 000个·孔-1的细胞，培养8 h至贴壁。取化合物溶液9.8μL与5.2μL DMEM培养基混合成15μL的溶液。取Cy5-eGFP(8μL,100 ng·μL-1）与7μL DMEM培养基混合成15μL的溶液，将Cy5-eGFP溶液缓慢加入到锍化合物溶液中，制备成30μL的复合物溶液。避光静置30 min后，加入到24孔板细胞液中，放置于37℃，5%CO2浓度培养箱中培养4 h，移除培养液，并用PBS溶液洗涤（8 min×3），加入4%多聚甲醛溶液静置30 min，进行细胞固定，用PBS溶液洗涤（10 min×3）后加入1%曲拉通溶液静置20 min，进行细胞膜打孔，再次用PBS溶液洗涤（15 min×3），用含DAPI的封片剂将细胞爬片固定在载玻片上，进行细胞核染色，在荧光显微镜下观察荧光分布情况。

2、结果与分析

2.1 化合物合成

阳离子脂质作为基因载体开发较多，其结构上多是质子化铵盐或以季铵盐为电荷中心，氮原子通过多种形式的链接基团，链接长链烷烃。阳离子脂质作为基因载体展现出较强的转染能力，但是仍然存在着不足之处，例如DNA装载量较低，细胞毒性较大等。在对新型阳离子脂质的开发中，调节分子结构与性能的关系，是重要的工作之一。锍化合物含有3个取代基，理论上3个取代基的链接可以依次逐步构建，通常先构建硫醚，然后再与碘代物或溴代物反应，即可以得到锍离子化合物。实验中锍离子链接的烷烃链发挥疏水缔合作用；引入酯基可以增加降解功能，羧基部分方便后续实验与其他官能团连接；引入羟基可以增强化合物的亲水能力，羟基也可以作为连接官能团，有利于二次嫁接功能基团。实验选取四个长度的烷烃链合成化合物C1-C4，化合物两步产率在41%～48%之间。在第二步反应中，化合物B中硫原子会进攻分子中的含羟基的碳原子，失去羟基，形成分子内三元环，因此影响产率。

2.2 凝胶阻滞实验

实验通过凝胶阻滞实验测试4个化合物对DNA的复合能力，效果如图2所示，C1在所测S/P下对DNA的复合能力很弱。C2在S/P为20/1时，DNA的迁移被阻滞，在S/P为25/1时，阻滞效果增强，但仍有部分DNA残余。C3、C4与DNA在S/P为1/1时，出现条带不规则，迁移变慢，说明化合物与DNA复合，并在S/P为5/1时，DNA的迁移完全被阻滞，证明已被完全复合。

图2 化合物对DNA在不同S/P时的凝胶阻滞图

文献报道具有相似线性结构的季铵盐、吡啶或咪唑，分别在N/P为1/1、3/1或10/1完全浓缩DNA[22]，锍类聚合物能够在S/P为5/1时完全复合DNA[21]。实验设计的化合物复合能力略小于报道的氮类脂质。分析文献报道的化合物分子结构，化合物中氮正电荷均位于分子的末端，可以高效地与DNA发生静电作用，而实验中化合物的锍正离子在3个取代基中间，受到较大的位阻，影响了与DNA的结合能力。长烷烃链取代基增强了化合物对DNA的缩聚，戊酸基乙酯与羟基乙基未体现出明显的作用。

2.3 化合物与DNA复合物的粒径、Zeta电势与形貌

根据凝胶阻滞实验结果，将C3、C4对DNA复合物的粒径与Zeta电势以及形貌进行测定。实验检测了在S/P为5/1、10/1的条件下，各复合物粒径与电势。如图3A，在S/P为5/1时，C3、C4对DNA复合物的粒径分别为360±30.8 nm和382±22.0 nm，在10/1时，粒径呈现缩小趋势，粒径分别为310±45.7 nm和201±10.6 nm。电势结果如图3B，在所有S/P下，化合物C3、C4与DNA复合物的Zeta电势均为正，C3随着S/P增加，电势增大，从+10±2.4 mV增加到+26±4.5 mV,C4与DNA复合物的电势变化较平缓，在+24～28 mV之间。形貌观察两种复合物均为球状，如图3C展示C3/DNA在S/P为5/1的形貌，大小约为350 nm。随着锍离子的比例增大，对DNA的缩聚增强，颗粒粒径有逐渐缩小的趋势。C3/DNA的电势在两个比例下，变动较大，C4/DNA的电势变动不大，这可能是因为C3的链长比C4小，在5/1时，结合的DNA较为松散。

图3 粒径、Zeta电势及形貌观察

2.4 化合物对HepG 2细胞毒性

实验通过MTT法测定了C3、C4对HepG 2细胞存活率的影响，结果如图4所示，C3、C4的细胞毒性随着浓度的增加而增加，实验测得出C3、C4在24 h时，IC50值分别为0.40±0.03和0.45±0.04 nmol·μL-1。在浓度大于1 nmol·mL-1时，对细胞的抑制较强。

图4 C3、C4作用24 h的HepG 2细胞存活率

2.5 化合物与DNA复合物的细胞摄取情况

C3、C4与Cy5-eGFP的复合物在HepG 2细胞上的摄取能力结果如图5所示，C3(C4）/Cy5-eGFP在S/P为5/1复合，细胞与复合物孵育2 h后，通过激光共聚焦显微镜检测摄取情况。结果显示，细胞缩小成圆形，细胞核完整，可见红色微弱荧光分布于细胞核周围化合物已经具备递送DNA进入细胞的能力，但递送能力较弱。实验尝试延长药品与细胞的共培养时间，但是细胞死亡增加，细胞膜破损严重。在此摄取条件下，化合物浓度达到25 nmol·mL-1，对细胞具有较大的毒性。实验中对摄取条件进行多种探索，一是降低DNA的用量，这种方法导致的结果是形成的复合物数量不够，细胞周围分布的复合物密度降低，被细胞摄取后荧光强度不能达到观测水平。二是降低S/P，但这种方法必然会导致对DNA的复合效果不理想，没法形成纳米颗粒，最终不能被细胞摄取。在此实验前提下，复合物要达到转染功能还需要降低化合物的毒性，增加对DNA的复合能力。对于锍离子脂质的结构优化将在现有的经验上进行探索。

图5 激光共聚焦显微镜观察C3(C4）/DNA复合物在HepG2细胞内分布情况

3、结论

实验探究了锍离子作为阳离子头部合成脂质基因载体，并初步研究其传递基因能力。锍阳离子头可以构建成一个三通结构的化合物，3个取代基可以根据用途采用不同结构的片段以达到应用效果，化合物合成可以分步通过取代反应完成。实验设计合成锍类阳离子脂质化合物，对化合物的DNA复合能力、复合物的粒径电势显示，当化合物中含有较长烷烃链时，具备传递DNA能力。细胞毒性实验显示IC50在0.40～0.45 nmol·mL-1之间，细胞摄取实验显示化合物具有一定的递送DNA进入细胞的能力，但由于毒性较大以及与DNA复合能力较弱等原因，仍需要结构优化，提高DNA负载能力，降低细胞毒性，在整体上提高其作为基因载体的能力。

参考文献:

[2]姜倩,岳冬,顾忠伟.脂质体传递系统的研究进展及临床应用概况中国材料进展[J].2017,36(11):813-826.

[5]罗婷婷,潘炜伦,涂嫣红,等.阳离子脂质体载药系统的制备及其体外成像治疗一体化应用研究[J].实用医学杂志,2022,38(5):627-632.

[6]秦尧,张新蕾,韩鑫桐,等.大麻二酚纳米结构脂质载体的制备及其性质研究[J].化学通报,2022,85(7):845-852.

[7]华雪莲,张树彪,肖义,等.新型阳离子脂质体制备及应用研究[J].化学研究与应用,2019,31(2):177-183.

[8]孙清瑞,申哲伟,李晶,等.叶黄素纳米结构脂质载体的制备与表征[J].黑龙江八一农垦大学学报,2021,33(4),53-59.

[9]宋恭帅,刘家源,袁雅雯,等.栀子黄脂质体的制备､表面修饰及体外消化稳定性研究[J].核农学报,2021,35(12):2799-2809.

[10]邢晨.雷公藤红素阳离子脂质体的制备及其对MRSA的抗菌作用研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2022.

[11]万蒙,陈懿琳,钱宇豪,等.阳离子脂质体包埋角鲨烯佐剂的制备及理化性质研究[J].中国畜牧兽医,2021,48(4):1431-1439.

[12]范超中,庄满意,温浩,等.白藜芦醇脂质体的制备及体外消化研究[J].农产品加工,2020,518(24):1-4.

基金资助:黑龙江省自然科学基金(SS2022B001)黑龙江省博士后科研启动资助项目(LBH-Q15115);黑龙江省“双一流”二期建设学科协同创新特区建设项目(LJGXCG2022-006); 黑龙江八一农垦大学三横三纵基金(ZRCPY202112);

文章来源:柳丙玲,张雷,刘成才,等.三取代锍类化合物的合成及其基因载体能力研究[J].黑龙江八一农垦大学学报,2024,36(06):86-92.