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研究分析人DDB2基因及蛋白质的生物信息学

2020-07-23 445 上传者：管理员

摘要：分析DNA损伤特异结合蛋白2(DDB2）基因的启动子、CpG岛、转录因子结合位点、基因表达情况；分析DDB2蛋白的理化性质、同源性、亚细胞定位、信号肽和跨膜区域、蛋白质结构及相互作用网络。DDB2基因至少含有2个启动子。启动子区存在2个CpG岛，长度分别109 bp和267 bp，而且至少包含NF-1和Sp1两个转录因子结合位点。DDB2基因在人体正常组织中均有表达，在白血病早幼粒细胞HL-60、721B淋巴母细胞中表达最高。DDB2蛋白是由427个氨基酸组成的无信号肽、无跨膜区域的亲水蛋白。主要定位于细胞核，二级结构以随机卷曲为主。还发现蛋白DDB1、CUL4A、CUL4B、XPA、COPS2、COPS4、COPS8、COPS5、COPS7B、TP53可能与DDB2存在相互作用。生物信息学对于基因及蛋白质研究具有重要作用。本文通过生物信息学的方法对DDB2基因及蛋白质进行分析，为DDB2的实验研究提供理论基础和新的线索。

关键词：
DDB2
人体生理
启动子区
生物信息学
病理生理学
蛋白
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DNA损伤特异结合蛋白2(damage specific DNA binding protein 2,DDB2）基因参与核苷酸早期损伤的切除修复，在DNA损伤与修复过程中发挥重要作用，此外还参与调节TGF-β/Smads信号通路相关基因的表达[1,2]。研究发现DDB2基因是痤疮的易感性位点，与相关的激素代谢、炎症发生和疤痕产生过程有重要关系[3]。此外，在小鼠中敲除DDB2基因，发现该基因与肿瘤抑制相关，可通过对B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,bcl-2）和p21的作用使细胞凋亡增强[4]。DDB2的表达与许多疾病密切相关，本文通过生物信息学的方法对DDB2基因及其蛋白质结构、亚细胞定位和潜在功能进行预测分析，期望能为进一步研究提供线索及方向。

1、材料与方法

1.1 DDB2基因启动子区序列及蛋白质序列的获取

登录NCBI数据库，在Gene中搜索DDB2，获得其相关信息。截取启动子区域序列，通常为转录起始点上游-2500bp-0 bp共2500bp[5]。以FASTA格式下载该序列，再进行后续分析。登录Uniprot(https：//www.uniprot.org/）数据库检索DDB2，下载人（Q92466）、鼠（Q99J79）、牛（Q0VBY8）、斑马鱼（Q2YDS1）、鸡（Q5ZJL7）、非洲爪蟾（Q66JG1）的蛋白质序列待后续分析。

1.2应用的分析软件

所用软件如表1所示，所有分析都使用软件默认参数进行。

2、结果与分析

2.1 DDB2基因分析结果

2.1.1 DDB2基因特征及表达情况

人DDB2基因的Gene ID为1643，在GeneBank中的登录号：NC＿000011，在人基因组中位于11p11.2，全长24277 bp，包含10个外显子和9个内含子，mRNA的登录号：NM＿000107，编码427个氨基酸构成的蛋白质。

BioGPS数据库显示，DDB2基因在人体正常组织中均有表达，在白血病早幼粒细胞HL-60、721B淋巴母细胞中表达最高，见图1。

表1文章所应用到的软件

图1 DDB2基因在人体各种组织的表达

表2 NNPP预测DDB2基因启动子区域结果

图2 EMBOSS CPGplot预测DDB2基因启动子区的CpG岛（A、B区域为预测的CpG岛位置）

图3 MethPrime预测DDB2基因启动子区的CpG岛（A、B区域为预测的CpG岛位置）

2.1.2 DDB2基因启动子区分析结果

预测结果分别为：（1)Neural Network Promoter Prediction(NNPP）提示DDB2基因上游可能存在7个启动子序列，具体见表2。（2)Promoter 2.0提示DDB2基因上游可能存在2个启动子区域，均为临界性预测，分别为1700 bp处和2000 bp处。（3)TSSW预测结果显示，DDB2转录起始点上游可能存在2个启动子，分别位于2446 bp处和1989 bp处。

2.1.3 DDB2基因CpG岛预测和分析结果

预测结果分别为：（1）在观察值/预期值>0.6,G%+C%>50%，长度>100bp条件下，EMBOSS Cpgplot在DDB2启动子区域检测到2个CpG岛。第1个岛位于942-1050 bp，长度为109 bp；第2个岛位于1969-2235 bp，长度为267 bp（图2）。

(2）在长度>100 bp,G%+C%>50%，观察值/预期值>0.6条件下，MethPrime一共预测到2个CpG岛。第1个岛位于942-1050 bp，长度为109bp；第2个岛位于1969-2235 bp，长度为267 bp（图3）。

故推测DDB2基因至少包含2个CpG岛，分别位于942-1050 bp和1969-2235 bp，长度分别为109 bp和267 bp。

2.1.4 DDB2基因转录因子结合位点分析结果

预测结果分别为：（1)AliBaba 2.1在检索TRANS-FAC 4.0数据库后，得到转录因子结合位点共249个，主要包括NF-1、Sp1、TBP、Oct-1、NF-kappa、C/EBPbeta、AP-1、Hb、GR、GATA-1等。（2)Cister在线软件分析转录因子结合位点具体结果见表3。

2.2 DDB2蛋白质分析结果

2.2.1 DDB2蛋白质的理化性质分析结果

根据ProtParam分析结果得到：人DDB2蛋白质共有427个氨基酸；分子质量为47863.97 Da；理论pI（等电点）值为9.56，属于碱性蛋白质；分子式为C2129H3343N613O640S21，原子总数为6710。在427个氨基酸残基中带负电荷的氨基酸残基（Asp+Glu）的数量为35，带正电荷的氨基酸残基（Arg+Lys）的数量为54。DDB2蛋白质的不稳定系数为45.64，属于不稳定蛋白质；脂肪系数为77.89；总的平均亲水性为-0.384，属于亲水性蛋白。图4为Protscale预测结果，位于22位的谷氨酸（E）亲水性最强，分值为-3.178；位于226位的甲硫氨酸（M）疏水性最强，分值为1.667。由图4可知DDB2蛋白的疏水区域少于亲水区域，属于亲水蛋白，该结果与ProtParam的结果一致，具有较高可信性。

2.2.2 DDB2蛋白序列比对和同源性分析

根据Clustal Omega的多序列比对结果，人DDB2蛋白的氨基酸序列与斑马鱼、鼠、牛、鸡和非洲爪蟾的相似性分别为：49.16%、78.45%、84.98%、56.4%、55.61%。如系统进化树图5所示，人与鼠和牛之间的进化距离小于人与非洲爪蟾、斑马鱼和鸡的进化距离。可见DDB2蛋白在哺乳动物中具有较高保守性，该蛋白的同源性与物种亲缘关系成正相关，故推测其在物种进化方面起着一定作用。

2.2.3 DDB2蛋白质的亚细胞定位、信号肽与跨膜结构域分析

PSORTII分析得到：DDB2定位于细胞核、细胞骨架、高尔基体、细胞质和质膜的概率分别为69.6%、13.0%、8.7%、4.3%和4.3%。故推测DDB2主要在细胞核中发挥生物学功能。SignalP 4.1的预测如图6所示，C、Y、S的最大值分别为0.111、0.104、0.113,S-mean的值为0.102,D值为0.103，可知DDB2蛋白不存在剪切位点，不是分泌蛋白。图7是THMM预测的DDB2蛋白的跨膜区域，结果显示该蛋白不存在跨膜区域，不属于膜蛋白。DDB2蛋白功能是修复DNA损伤，主要在细胞核内完成生物学过程，不需要进行跨膜转运，通过核孔复合体直接进入细胞核，与相应的DNA结合从而发挥作用。

表3 Cister预测转录因子结合位点结果

图4 ProtScale分析DDB2蛋白的亲疏水性

图5 MEGA构建的人DDB2蛋白与同源序列的系统进化树

图6 DDB2蛋白信号肽预测结果

图7 DDB2蛋白跨膜区域预测结果

图8 DDB2蛋白二级结构预测结果

2.2.4 DDB2蛋白质二级结构、三级结构预测

SMOPA预测的DDB2蛋白质的二级结构结果如图8所示，随机卷曲（橘色）占51.29%，延伸链（红色）占29.04%，α螺旋（蓝色）占11.94%，β转角（绿色）占7.73%。这说明DDB2蛋白质中大部分氨基酸位于有序的结构中，并处于比较松散的状态，这有利于蛋白质进行正常的生理过程。蛋白质的结构决定功能，解析蛋白质的高级结构有利于对其功能进行深入研究。SWISS-MODEL预测的DDB2蛋白质的三维结构如图9所示，模板覆盖率为1.00，序列与模板相似度为0.62。

2.2.5 DDB2蛋白质相互作用网络

在人体中需要蛋白质的相互作用才能完成正常的生理过程，通过STRING预测DDB2蛋白的相互作用网络，结果显示，与其紧密联系的前10位蛋白质，分别是：DDB1、CUL4A、CUL4B、XPA、COPS2、COPS4、COPS8、COPS5、COPS7B、TP53。

3、讨论

人DDB2基因定位于11号染色体11p11.2，由10个外显子和9个内含子组成，有16种转录产物。DDB2作为一种重要的核蛋白，主要功能是参与核苷酸的切除修复，识别DNA损伤位点，还可参与基因转录、调节细胞周期、染色质重构和蛋白质衰变等重要生物学过程。越来越多的研究表明，DDB2的结构改变和功能障碍可导致多种疾病与癌症的发生，如着色性干皮病、前列腺癌、结直肠癌、皮肤癌[6]、肺癌[7]等。

启动子作为RNA聚合酶和某些转录因子的特异识别位点，对基因转录的起始起调控作用。对于DDB2启动子的研究有助于后续对该基因转录调控机制的深入研究[8]。启动子通常位于基因转录起始点上游，大约包含2500 bp，能被RNA聚合酶特异性识别、结合从而启动转录，但其本身并不被转录。对基因启动子序列的研究是了解基因转录调控的重要理论前提。运用生物信息学技术对启动子进行分析主要是以DNA的碱基序列为基础，大致分为启动子区域确定和启动子调控序列分析两种方法[9]。本文通过NNPP、Promoter2.0、TSSW 3种在线软件对DDB2基因启动子区域进行分析，发现至少存在2个启动子，分别位于2096-2146bp处和2339-2389bp处。

CpG岛甲基化是表观遗传学中的重要修饰形式，如果发生在基因启动子区域可导致基因沉默，使重要基因表达降低或者不表达，从而导致疾病的发生[10]。这种功能在肿瘤细胞增殖中尤为重要，研究表明DNA部分去甲基化可导致原癌基因转录活跃，因此对CpG岛的研究在肿瘤诊断领域拥有重要地位。本文通过在线软件预测，发现DDB2基因可能存在2个CpG岛，分别位于942-1050bp和1969-2235bp，长度分别为109bp和267bp。MethPrime和EMBOSS Cpgplot两个软件预测位置一致，结果相对可靠。

图9 DDB2蛋白三级结构预测结果

转录因子（Transcription Factor）通过与RNA聚合酶结合共同参与转录起始过程，可分为普遍转录因子和组织细胞特异性转录因子两类。各种转录因子对不同的细胞信号和外界刺激做出反应，通过激活或者抑制转录过程控制基因的表达过程[11]。本文分别运用在线软件AliBaba 2.1和Cister对DDB2基因转录因子结合位点进行预测。NF-1和Sp1两个转录因子为两者的共同预测结果。

本文对DDB2蛋白进行深入分析，发现DDB2蛋白质是由427个氨基酸组成的无信号肽、无跨膜区域的不稳定亲水蛋白，等电点为9.56；主要定位于细胞核；二级结构以随机卷曲为主。通过多重序列比对发现DDB2蛋白在哺乳动物中保守性高。通过蛋白质相互作用分析发现蛋白DDB1、CUL4A、CUL4B、XPA、COPS2、COPS4、COPS8、COPS5、COPS7B、TP53可能与DDB2存在相互作用，DDB2可能发挥的功能也可以从与它存在相互作用的蛋白中发现一些线索。

本文首次用生物信息学方法分析了DDB2基因的启动子、CpG岛及转录因子结合位点情况，以及其编码蛋白质的理化性质、亚细胞定位、信号肽、跨膜区域、蛋白结构和蛋白相互作用等。这些分析结果可为后续实验研究DDB2基因功能及表达调控提供理论依据和重要线索。

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基金:国家自然科学基金资助项目(NO:81760565).