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小分子化合物组合改善多能干细胞向脑类器官分化的效率

2024-05-31 48 上传者：管理员

摘要：目的优化多能干细胞(PSCs)定向分化为脑类器官的条件，提高人脑类器官的分化效率。方法利用人胚胎干细胞(hESCs)系H9向人脑类器官诱导分化体系，在早期脑类器官分化到神经祖细胞的发育阶段添加小分子化合物组合，通过形态学观察不同分化阶段脑类器官中的神经祖细胞形成的效率、细胞凋亡的情况以及分化成神经元的效率，通过RT-qPCR检测标志性基因的表达量，综合评估添加的小分子化合物组合对脑类器官形成的影响。结果在脑类器官神经祖细胞发育的关键阶段(1 d～14 d),培养基中依次添加多索啡(dorsomorphine)、A83-01、GSK-3β抑制剂CHIR99021和SMAD抑制剂SB-431542,可使神经祖细胞阶段的相关标志性基因的表达量显著提高，促进特异性神经管样结构形成，脑类器官中心区域的细胞凋亡减少。结论通过使用上述4种小分子化合物组合，可明显提高早期脑类器官的形成效率，减少脑类器官中的细胞凋亡、促进神经元形成，减少培养过程中的组织结构异质性。

关键词：
PSCs
多能干细胞
小分子化合物
神经分化
脑类器官
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多能干细胞(pluripotent stem cells, PSCs)主要包括胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs),具有多向分化潜能[1],可在体外经定向诱导分化形成三维结构的类器官[2]。脑类器官的生成基于拟胚体(embryoid bodies, EB)样聚集物的无血清培养[3]。EB生成时，小分子化合物和生长因子被用于整个分化过程，以指导hPSCs形成代表特定大脑区域的细胞和组织，如大脑皮质、海马和中脑[4]。人源多能干细胞(hPSCs)分化的脑类器官由于与内源性细胞组织和器官结构相似，可以为再现人类大脑发育和神经系统疾病提供一个非常有价值的体外模型。尽管脑类器官技术具有巨大的研究价值及应用潜力，但目前的诱导体系仍存在一些局限性，如不同实验室之间采用的诱导方法不同导致了当前的大脑皮层类器官系统中存在较高的异质性，此种异质性通常表现为神经上皮的标志性玫瑰花结样结构(rosette)形态不一且体积较小；在长期培养过程中，脑类器官本身由于氧和营养的扩散限制会导致在中心区域出现细胞大量凋亡的情况，无法模拟神经发生的后期阶段[5]。因此，为获得均质性高、诱导分化效率高的脑类器官培养体系，需要在现有诱导过程中合理使用外部因子调节hPSCs的自组织和细胞间的相互作用以优化培养体系。

由于Wnt通路激活已被证明可诱导皮质神经上皮的侧向扩张[6],因此有实验为减少组织发育前期的异质性，采用2 μmol/L双SMAD抑制剂多索啡(dorsomorphin, Dorso)和A83-01处理，可诱导EB向特定大脑区域分化，然后在神经上皮出芽后应用1 μmol/L GSK-3β抑制剂CHIR99021和SMAD抑制剂SB-431542处理，可显著降低类器官的异质性，促进神经祖细胞(neural progenitor cells, NPCs)发育，减少半胱天冬酶3(Caspase3)蛋白标记的凋亡细胞数量[7]。目前，诱导形成人脑类器官的体系多种多样，为了不断标准化及优化大脑皮层类器官的培养条件，本研究利用商品化脑类器官诱导培养基，在胚胎干细胞系H9向大脑皮质类器官分化的体系中依次添加Dorso、A83-01、CHIR99021和SB-431542这4种小分子化合物，观察该诱导体系对脑类器官早期神经祖细胞和神经元的发育及细胞凋亡的影响，减少异质性，从而使该体系下获得的大脑皮质类器官能更真实地模拟人脑的结构和功能，为构建生理及病理情况下的人脑类器官模型提供支持。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：

人胚胎干细胞系H9[8](hESCs-H9,第50～60代，来自美国威斯康辛州WiCell研究所， NIH批准文号： NIHhESC-10-0062)。

1.1.2 主要试剂：

mTeSRTM Plus细胞培养基、Gentle Cell Dissociation Reagent(GCDR)、STEMdiffTM Cerebral Organoid Kit、STEMdiffTM Cerebral Organoid Maturation Kit(Stem Cell公司);ROCK 抑制剂Y-27632(Tocris公司);DPBS磷酸盐缓冲液，rhVTN-N玻连蛋白(Gibco公司);Matrigel基质胶(Corning)公司；多索啡、A83-01、GSK-3β抑制剂CHIR99021(CHIR)和SMAD抑制剂SB-431542(SB)(MCE公司);Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit、FastStart Universal SYBR Green Master Mix(Roche公司);PBS 磷酸盐缓冲液(北京中科迈晨科技有限公司);4 %组织细胞固定液、Tween-20、Triton X-100、驴血清、一抗稀释液、抗体稀释液、DAPI 溶液、抗荧光衰减封片剂(北京索莱宝科技有限公司); Anti-SOX2抗体、Anti-βⅢ-tubulin抗体、Anti-Caspase3抗体、驴抗兔、驴抗小鼠二抗(Abcam公司);引物(上海生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 H9细胞的培养：

按5×105个/孔的比例接种到rhVTN-N玻连蛋白包被的6孔板上，每天用mTeSR培养基换液，37 ℃,5% CO2培养。细胞汇合度达到80 %时用GCDR消化，按1∶4～1∶6传代。

1.2.2 PSCs诱导形成脑类器官：

采取STEMdiffTM Cerebral Organoid Kit试剂盒加细胞因子添加物方式进行诱导，诱导经历EB形成(0～5 d)、诱导(5～7 d)、扩增(7～10 d)和成熟(10～40 d)4阶段，诱导步骤参考文献[9],简述如下：

1)EB形成(0～5d):

将H9计数传代按每孔9 000个细胞接种到圆底超低黏附的96孔板上，每孔100 μL EB形成培养基，0 d需添加10 μmol/L Y-27632。2 d和4 d每孔分别补加100 μL EB形成培养基。

2)诱导(5～7d):

5 d在新的圆底超低黏附的96孔板中每孔添加300 μL诱导培养基，使用200 μL宽口枪头将EB一一转入新孔中。

3)扩增(7～10d):

7 d在圆底超低黏附的6孔板中每孔添加3 mL扩展培养基，解冻Matrigel基质胶，每个EB上滴加15 μL Matrigel, 37 ℃静置30 min后转移到6孔板中，每孔15个EB,37 ℃、5% CO2条件下静置培养3天。

4)成熟(10～40d):

10 d缓慢吸弃上清，每孔更换为3 mL成熟培养基，将孔板放于60 rpm的定轨振荡器上，37 ℃、5% CO2条件培养，每3～4 d换液。

对照组(control, Con)按以上步骤正常培养；实验组(Dorso/A83/CHIR/SB,DACS)在1 d～7 d换液时添加2 μmol/L dorsomorphine+2 μmol/L A83-01,7 d～14 d换液时添加1 μmol/L CHIR99021+1 μmol/L SB-431542。

1.2.3 RT-qPCR:

在脑类器官发育14 d用Trizol法提取总RNA,测量浓度后使用Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit逆转录为cDNA。采用FastStart Essential DNA Green Master Mix在LightCycler 96 Real-Time System上进行RT-qPCR,根据2-△△Ct计算基因相对表达量。GAPDH为内参基因，SOX2和PAX6为脑类器官神经祖细胞发育阶段的相关标志性基因，半胱天冬酶3蛋白(Caspase3)为凋亡标记基因，引物序列见表1。

1.2.4 脑类器官冰冻切片和免疫荧光：

脑类器官发育14 d和35 d固定脱水包埋，冰冻切片厚度20 μmol/L,0.25% Triton X-100 室温(RT)通透30 min, 5%驴血清室温封闭20 min, 分别加入SOX2和βⅢ-tubulin抗体，4 ℃过夜孵育后用PBS洗3遍，加入对应的二抗RT孵育2 h; DAPI染核5 min, PBS洗片后加入抗荧光衰减封片剂封片，DM6 B正置荧光显微镜下拍照观察。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3 统计学分析

数据应用Image J、GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示。t检验比较每两组差异，所有实验重复3次以上。

2、结果

2.1 优化的分化体系中可以检测到不同分化阶段的相应细胞形态及基因表达

本研究中的诱导培养基为商品化培养基，在此基础上依次添加小分子化合物观察其对诱导分化成大脑皮质类器官的影响，本研究分化方法如图1。结果表明，该培养体系下，脑类器官在发育1 d～7 d自聚集成边缘光滑清晰致密的拟胚体；8 d～10 d体积进一步增大，逐渐出现神经上皮的标志性神经管样结构，组织中心致密；在随后培养过程中形成皮质脑类器官典型状态(图2)。

2.2 优化的分化体系能提高神经祖细胞的产生效率

本研究在脑类器官发育第14天，对神经祖细胞标志基因的表达量进行了RT-qPCR检测(图3),观察到优化的DACS组比Con组SOX2、PAX6表达量显著升高(P<0.001)。免疫荧光检测脑类器官分化早期神经祖细胞(SOX2)和新生神经元(βⅢ-tubulin)阶段蛋白标志maker的表达，观察到生成的2组类器官混合细胞类型中表现出不同程度的神经发生。第14天检测到SOX2+心室区样(VZ)层，但DACS组比Con组SOX2+神经花环样神经管结构明显且完整；此阶段两组均检测到极微量的新生神经元标志物β3-微管蛋白(βⅢ-tubulin)的表达。进一步对成熟培养35 d的脑类器官进行细胞免疫荧光染色，发现DACS组仍比Con组神经管数量多，SOX2表达更高；两组中还观察到新生神经元微管蛋白βⅢ-tubulin的表达，DACS组表达量仍显著高于Con组(图4)。

图1 人胚胎干细胞H9向脑类器官分化方案示意图

图2 人胚胎干细胞H9向脑类器官分化不同阶段形态图

2.3 优化的分化体系减少细胞凋亡

对脑类器官分化过程的细胞状态进一步观察，在第14天通过RT-qPCR检测发现DACS组Caspase3细胞凋亡基因表达量显著低于Con组(图5);在第35天通过免疫荧光检测发现Caspase3标记的凋亡细胞主要出现在类器官的中心和边缘区域，但DACS组比Con组中心区域Caspase3+细胞面积小，统计免疫荧光结果发现DACS组Caspase3蛋白表达量显著低于Con组，证明四种小分子可以在一定程度促进脑类器官中心区域神经细胞的存活(图6)。

图3 RT-qPCR分析H9细胞向脑类器官分化14 d标志基因mRNA的表达

3、讨论

三维培养体系下的大脑皮质类器官的诱导方法多样，从无抑制条件到双SMAD抑制剂。Wnt抑制剂及二者联合抑制。无论使用何种诱导方法，脑类器官都可以形成团块样三维结构，表达神经/皮质标志性基因并表现出神经细胞结构特征。然而培养过程中使用不同添加物和不同方法会导致不同的神经发育模式，脑类器官会表现出异质性并对检测表型的有效性产生一定影响。有研究表明脑类器官的异质性体现在类器官早期NPCs的低效生成[10]。与生长因子等相比，小分子化合物具有高重复性和高稳定的特点。本实验通过4种小分子的协同作用促进了皮质分化，形成了稳定的皮质生发区——SOX2+的脑室区细胞结构，减少了脑类器官建模过程的异质性，增加了检测表型的有效性。

图4 免疫荧光分析H9细胞向脑类器官分化14 d和35 d 标志蛋白的表达

图5 RT-qPR分析H9细胞向脑类器官分化14 d凋亡标志基因mRNA的表达

目前脑类器官研究取得了广泛进展，脑类器官除了被小分子化合物、细胞因子诱导外，还可以联合生物材料、微/纳米技术和干细胞驱动的组织进行培养，这些技术在一定程度改善和补充了现有的模型系统[11]。目前，已证实血管化脑类器官可大幅度提高其体外存活率，可能提供更多氧气来支持细胞存活，从而减少细胞调亡[12,13]。研究证实SOX2+的神经祖细胞对氧气、营养物质和培养基生长因子的暴露量最高，可被看作体外血管周围生态位的等效物[14],因此在该阶段加入小分子化合物主要促进了神经祖细胞的发育，对脑类器官细胞状态的改善具有重要意义。另外，本研究还观察到在添加4种小分子后新生神经元数量增多，但在脑类器官持续发育过程中， 4种小分子对兴奋性、抑制性神经元或胶质细胞分化发挥的作用还需要进一步分析。

综上，本研究对现有的缺乏血管系统的脑类器官培养体系进行了优化，通过在神经祖细胞发育阶段添加dorsomorphine、A83-01、CHIR99021和SB-431542这4种小分子化合物组合，显著促进了脑类器官中神经祖细胞的发育和皮质新生神经元的产生，改善了脑类器官中细胞存活状态，减少了培养过程中的异质性，说明本研究成功建立了一种能提高hPSCs向大脑皮质类器官分化效率的方法，为建立生理及病理性脑类器官模型奠定了基础，可促进相关的基础和临床研究。

图6 免疫荧光分析H9细胞向脑类器官分化35 d 凋亡标志蛋白的表达

基金资助:国家自然科学基金(82101545);中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2022-I2M-1-002,2022-I2M-2-001);中央高水平医院临床科研业务费(2022-PUMCH-D-002);

文章来源:朱宛宛,周金娟,修建波.小分子化合物组合改善多能干细胞向脑类器官定向分化的效率[J].基础医学与临床,2024,44(06):786-792.