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鼠尾静脉注射装载脑抗原的纳米粒子治疗手术脑损伤的实验研究

2021-12-04 221 上传者：管理员

摘要：目的:研究装载髓鞘碱性蛋白（MBP）的纳米粒子的物理、化学特性,探讨鼠尾静脉注射装载MBP的纳米粒子诱导免疫耐受治疗手术脑损伤（SBI）继发性炎症的疗效。方法:（1）采用乳化溶剂挥发法合成含有支链普鲁兰多糖的聚乙烯醇（PVA）修饰聚-（β氨基酯）(PBAE)/聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）芯的纳米粒子;（2）30只雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、对照组及实验组,每组10只。假手术组只开骨窗,保持硬脑膜的完整;对照组和实验组建立SBI模型,对照组经鼠尾静脉注射装载生理盐水（NS）的纳米粒子,实验组经鼠尾静脉注射装载同种异体MBP的纳米粒子。分别于SBI后1、7、14、21d通过ELISA检测外周血血清中IL-2、IL-4水平,流式细胞术检测外周血CD4+/CD8+T细胞比值,进行改良神经功能缺陷评分（MNSS）。SBI后第21天以脑组织切片免疫组织化学染色法检测神经小胶质细胞的表面标记物离子钙接头分子（Iba-1）表达水平。结果:（1）成功制备装载MBP或NS的纳米粒子,平均直径分别为266.4nm和287.5nm,平均Zeta电位值分别为14.2mV和9.7mV,电子显微镜观察具有典型的"核-壳结构";（2）术后第7、14、21天,实验组MNSS低于对照组,对照组高于假手术组（P<0.05）。术后第7、14天,假手术组和实验组IL-2浓度低于对照组（P<0.05）,假手术组和对照组IL-4浓度低于实验组（P<0.05）。术后第7、14、21天,假手术组和实验组CD4+/CD8+T细胞低于对照组（P<0.05）。术后21d大鼠脑组织切片Iba-1表达阳性的细胞显微镜下呈棕黄色,实验组Iba-1表达量较对照组明显降低。结论:（1）本实验设计的新型纳米粒子对MBP具有高效和稳定的装载性;（2）鼠尾静脉注射装载MBP的纳米粒子能诱导机体产生免疫耐受,降低SBI术后继发性炎症反应及脑神经功能缺陷,可激活小胶质细胞从而保护脑神经细胞。

关键词：
PBAE/PLGA纳米粒子
免疫耐受
手术脑损伤
血脑屏障
髓鞘碱性蛋白
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中枢神经系统被认为是免疫特惠器官，神经外科手术在治疗疾病的同时引起血脑屏障破坏导致非疾病本身的神经系统炎症反应，称为“手术脑损伤（SBI）”[1]。研究表明，SBI破坏血脑屏障，导致许多大分子物质释放至细胞外，通过受损的血脑屏障进入血液循环，引起机体免疫系统针对脑抗原产生大量抗体，导致脑水肿、神经元损害及神经细胞凋亡，引起不可逆的神经功能损伤[2]。目前治疗SBI后继发性炎症反应的方法包括脱水降颅压、类固醇激素抗炎、营养神经、亚低温疗法以及免疫抑制剂等，这些疗法会抑制免疫系统功能，易诱发感染及肿瘤的发生[3]。因此，寻求一种高效、安全、精准的保护神经方法成为现代神经外科的研究热点。

小胶质细胞是中枢神经系统中第一道也是最主要的免疫防线。SBI后致继发性炎症反应，固有的小胶质细胞快速分裂并清除损伤区域濒死的细胞碎片、重塑损伤区脑组织及预防神经元的损伤。当中枢神经系统受到损伤后，小胶质细胞表现出高度的形态可塑性，可从静息态转变成激活状态的阿米巴状，这一过程又被称为“功能可塑性”过程[4]。SBI后小胶质细胞表面抗原标志物离子钙结合衔接分子-1(ionizedcalciumbindingadaptormolecule-1,Iba-1）蛋白表达量增加，检测Iba-1蛋白的表达量可反映小胶质细胞的活化程度。

髓鞘碱性蛋白（myelinbasicprotein,MBP）在中枢神经系统中的含量仅次于髓鞘蛋白脂蛋白，约占髓鞘蛋白总量的30%，中枢性MBP由少突胶质细胞合成和分泌，蛋白质含量最高，MBP含有多种抗原物[5]。因此，本实验通过鼠尾静脉注射装载MBP的纳米粒子诱导免疫耐受，减轻SBI引起的继发性炎症反应。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

无特定病原体级雄性SD大鼠30只，体重250～270g（军事医学科学院实验动物中心），适应性饲养7d后按随机数字表法分为假手术组、对照组及实验组，每组10只。

1.1.2 主要试剂与仪器

试剂：普鲁兰多糖（分子量200kD）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，分子量20kD）、聚-（β氨基酯）（PBAE，分子量以聚苯乙烯为标准28kD，济南岱罡生物工程有限公司）；MBP（瑞士EnzoLifeSciences公司）；IL-2、IL-4ELISA试剂盒（武汉博士德生物公司）；异硫氰酸荧光素（FITC）抗-CD3、别藻蓝蛋白（APC）抗-CD4、藻红蛋白（PE)-CD8a抗体及同型对照抗体（美国BD公司）；Iba-1抗体（英国Abcam公司）。仪器：粒径及电位分析仪（英国ZetasizerNanoZS公司）；透射电子显微镜（日本HitachiHT7700公司）；酶标仪（美国Bio-Rad公司）；CantoⅡ流式细胞仪（美国BD公司）；显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 PVA/PBAE/PLGA/MBP纳米粒子的制备

参照文献[6]提供的方案制备纳米粒子。首先，采用乳化溶剂挥发法制备装载MBP的PLGA/PBAE纳米粒子核。如下：将4mgPBAE和20mgPLGA分别溶于1ml二氯甲烷，搅拌混匀后加入100μlMBP(1.0mg/ml),4℃冰浴条件下搅拌，通过超声细胞粉碎仪调节超声功率为200W对其超声乳化处理3min，形成一种水/油（W/O）纳米乳化液。然后以含有支链普鲁兰多糖的聚乙烯醇（polyvinylalcohol,PVA）修饰PBAE/PLGA纳米核的表面。如下：将100mgPVA和100mg普鲁兰多糖溶于10ml超纯水，获得1%的PVA，将上述PBAE/PLGA初乳滴加至4ml的PVA溶液中，超声乳化处理后形成一种水/油/水（W/O/W）纳米乳化液，将其添加至5ml的2%异丙醇溶液中，在室温通风下持续800r/min搅拌2h去除二氯甲烷。纳米粒子经反复离心、水洗，即获得乳化状装载MBP的PVA/PBAE/PLGA纳米粒子。PVA/PBAE/PLGA/MBP纳米粒子以0.5mg/ml分散于超纯水中。采用动态激光散射法检测其粒径，Zeta电位测定仪检测表面电位，观察其表面荷电性质；采用透射电子显微镜观察纳米粒子的形貌。

1.2.2 大鼠SBI模型制备

参照文献[7]所述方法构建大鼠SBI模型：腹腔内注射10%水合氯醛麻醉（0.3ml/100g体重）。全麻诱导后，备皮暴露皮肤，大鼠固定于立体定向仪，头部碘伏常规消毒3次。无菌条件下矢状位切开头皮，棉球压迫止血，拉钩牵开头皮并固定，暴露右侧额骨，于颅骨矢状缝右侧2mm，冠状缝后1mm交点处，磨钻开骨窗4mm；手术尖刀切开硬脑膜后锐性切除大小约2mm×3mm×3mm脑组织，确切止血后逐层缝合伤口。随后，对照组和实验组分别经鼠尾静脉注射200μl装载NS和装载MBP的纳米粒子。假手术组以同样方法开骨窗，但保持硬脑膜完整。

1.2.3 神经系统行为学评分

分别于SBI后1、7、14、21d，参照文献[8]制定的神经功能缺损评分量表（modifiedneurologicalseverityscore,MNSS）对大鼠进行神经功能缺陷评分，评分包括5个方面：提尾反射（0～3分）、行走测试（0～3分）、感觉测试（0～2分）、平衡测试（0～6分）、反射缺失和反常运动（0～4分），大鼠缺失1项反射或不能完成测试即计相应分数，分数越高，损伤越重。

1.2.4 大鼠血清IL-2、IL-4浓度检测和CD4+/CD8+T细胞比值

分别于SBI后1、7、14、21d，腹腔内注射10%水合氯醛麻醉（0.3ml/100g体重），仰卧位固定，经心脏穿刺取血1ml，取其中800μl血室温置于促凝管中，10min后3500r/min离心15min，取上层血清于EP管中储存于-80℃，根据ELISA试剂盒检测大鼠血清中IL-2和IL-4浓度；取剩余的200μl血室温置于EDTA抗凝管中后，分别取100μl滴加于2支流式管底部，每管加入2ml红细胞裂解液，按照流式细胞抗体试剂盒说明书，利用流式细胞仪检测CD4+T、CD8+T细胞，并计算CD4+/CD8+T细胞比值。

1.2.5 小胶质细胞免疫组织化学染色

在SBI后第21天，腹腔内注射10%水合氯醛麻醉（0.3ml/100g体重）后仰卧位固定，打开胸腔后经心脏灌注PBS溶液100ml，再灌注4%多聚甲醛200ml后开颅取脑组织，经4%多聚甲醛固定后进行石蜡包埋，选取SBI边缘旁1mm左右处切片。利用二甲苯及乙醇脱蜡，将玻片放入柠檬酸钠修复液中加热水浴修复，加入Iba-1抗体在4℃条件下孵育12h，滴加DAB显色液，苏木紫复染，显微镜观察并选取5个不同视野拍照。

1.3 统计学分析

采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，统计图由Graphpadprismsoftware(version5.01）绘制。数据用表示，呈正态分布的多样本均数间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA）处理数据，组间比较采用SNK法，P<0.05即为统计学差异具有显著性的界值。

2、结果

2.1 纳米粒子的物理特性

制备装载MBP和NS的纳米粒子粒径分别为266.4nm和287.5nm，各纳米粒子的多分散指数均小于0.2，说明粒径分布较为均匀；Zeta电位分别为14.2mV和9.7mV，见表1；电镜下纳米粒子呈规则的球形和典型的“核-壳”结构，见图1。

2.2 改良神经系统行为学评分

大鼠SBI后各组神经功能均有不同程度的缺陷，与假手术组相比，对照组和实验组术后出现明显神经系统功能缺失。术后7、14、21d，实验组MNSS得分低于对照组，术后1、7、14、21d，对照组和实验组高于假手术组，差异有统计学差异（P<0.05）。见表2。

2.3 大鼠血清IL-2和IL-4浓度

SBI术后7、14d，实验组和假手术组IL-2浓度低于对照组，差异有统计学差异（P<0.05）。见表3。术后7、14d，假手术组和对照组IL-4浓度低于实验组，假手术组IL-4浓度低于对照组，差异有统计学差异（P<0.05）。见表4。

2.4 外周血CD4+/CD8+T细胞比值

术后7、14、21d，假手术组CD4+/CD8+T细胞比值低于对照组，术后7、14d，实验组低于对照组，差异有统计学差异（P<0.05）。见表5。

2.5 神经小胶质细胞免疫组织化学染色

术后第21天脑组织切片神经小胶质细胞Iba-1的表达，实验组明显低于对照组，实验组及对照组均高于假手术组。见图2。

3、讨论

颅脑创伤及神经外科手术都会破坏血脑屏障导致大量混合脑抗原暴露于免疫系统，进而使血清中抗脑抗原抗体含量明显升高，通过抗原抗体反应激发自身免疫引起脑组织的继发性炎症反应进一步加重脑肿胀、脑水肿、神经元损害、神经细胞凋亡，引起不可逆的神经功能损伤[9]。既往研究表明，建立免疫耐受能够有效抑制继发性的炎症反应进而达到治疗SBI的目的[10]。

神经系统行为学功能评分能直接反应神经功能状况，SBI后大鼠将出现各种神经功能障碍，因此采用神经系统行为学评分作为客观评价治疗预后的指标。T淋巴细胞是细胞免疫的重要组成部分，尤其是CD4+T和CD8+T细胞。YILMAZ等[11]研究发现在大脑缺血-再灌注损伤的脑组织中，CD4+T细胞增多，CD8+T细胞减少，外周血CD4+T/CD8+T增高。辅助性CD4+T细胞可分化为Th1和Th2。细胞因子是淋巴细胞转运的重要调节因子，IL-2是细胞免疫重要的促炎因子，IL-2主要由活化的Th1产生，且IL-2可加强T淋巴细胞活化，因此，IL-2的表达反映了Th1的活化水平[12]。IL-4具有免疫调节作用，主要由Th2产生，是Th2特征性的细胞因子，又诱导Th2细胞分化。此外，WALSH等[13]研究发现，IL-4对损伤的中枢神经系统具有保护和促进恢复的功能。

小胶质细胞是中枢神经系统的单核/巨噬细胞，占神经胶质细胞总数的5%～20%。小胶质细胞的形态分为分枝状和阿米巴状，正常情况下小胶质细胞处于静息状态，表现为胞体较小、突起较长的分枝状。当中枢神经系统损害后，继发性炎症反应发生，刺激小胶质细胞被迅速激活，形态上表现为胞体变大、突起回缩的阿米巴状，发挥吞噬作用。Iba-1是小胶质细胞特异性的钙结合蛋白，参与激活的小胶质细胞的皱褶形成和吞噬作用。活化的小胶质细胞一方面发挥吞噬作用，分泌生长因子促进神经修复；另一方面也能分泌一些炎症因子，加重继发性炎症反应。MIYAMOTO等[14]研究发现，颅脑损伤后，小胶质细胞表面抗原标志物Iba-1蛋白表达增加，检测这种蛋白的表达量可反映小胶质细胞的活化程度。本实验探究小胶质细胞在SBI后的反应、激活的形态特点，精确调控小胶质细胞的反应，以减少细胞毒性物质的释放，治疗神经损伤。

有研究表明，可通过肝门静脉注射单一或混合脑抗原诱导建立特异性免疫耐受降低继发性炎症反应治疗SBI，然而在临床上肝门静脉注射需要开腹或腹腔镜来协助进行，不仅操作难度大，而且增加手术并发症[15]。因此，本试验设计了一种免疫原性低的纳米粒子作为MBP的载体，通过鼠尾静脉途径注射装载MBP的纳米粒子，并对SBI后小鼠的行为学评分、血液免疫指标、小胶质细胞活化情况进行综合评估，证实了无创的外周静脉输液途径可以诱导机体产生免疫耐受，降低SBI后继发性炎症反应。为将来临床神经外科治疗SBI引起的继发性炎症反应提供新的方向。

参考文献:

[7]刘勇,六建民,张明超,等门静脉注射髓鞘碱性蛋白诱导免疫耐受的研究[J].中华实验外科杂志,2016,33(4)975-978.

[8]张洪伟,闫华,武俏丽,等口服免疫耐受治疗颅脑创伤的实验研究[J].中华神经外科杂志,2011,27(5)524-527.

文章来源：田震,朱能,李子林,张新华,陈永忠.鼠尾静脉注射装载脑抗原的纳米粒子治疗手术脑损伤的实验研究[J].中国免疫学杂志,2021,37(24):2960-2964.