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复方蛹虫草口服液镇静催眠作用及安全性

2024-10-14 169 上传者：管理员

摘要：目的探讨复方蛹虫草口服液(Compound Cordyceps militaris oral liquid, CCMOL)的镇静催眠作用及安全性。方法通过小鼠自主活动试验、戊巴比妥钠协同试验观察CCMOL对小鼠的镇静作用及对对氯苯丙氨酸致失眠小鼠的催眠作用。采用小鼠急性毒性试验、遗传毒性试验评价CCMOL的安全性。结果与失眠模型小鼠比较，3、15、30 mL/kg体质量的CCMOL均可显著降低小鼠自主活动次数(P<0.05或P<0.01),增加阈下剂量戊巴比妥钠小鼠入睡数量，缩短阈剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期(P<0.01),延长睡眠时间(P<0.01)。CCMOL对雌、雄小鼠的急性经口最大耐受剂量均大于67 mL/kg。小鼠骨髓微核试验、精子畸形试验及细菌回复突变试验(Ames)结果均为阴性。结论 CCMOL具有良好的镇静催眠作用，且未见明显毒副作用。

关键词：
中药新品种
改善睡眠
毒性
脏腑气血阴阳平衡
蛹虫草
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睡眠障碍已成为被世界广泛关注的公共问题[1]。中医药改善睡眠障碍遵循中医辨证理论，能够通过调整脏腑气血阴阳平衡，使机体恢复正常状态[2],在治疗失眠方面具有突出优势。具有改善睡眠功能的中药材种类众多[3],其中，药食同源的中药在保健食品、养生药膳及日常保健中应用更为广泛。有研究[2,4]在养心、安神、补虚等传统中药基础上，开发了许多对失眠症具有较好疗效的中药新品种。目前，我国药典和基本药物目录等收载的治疗失眠的中成药有95种，涵盖198味中药材[5],改善睡眠的保健食品有594种[2],但就我国中药的开发前景和镇静催眠药物市场需求而言还远远不够。

有研究[6]报道，蛹虫草多糖和总黄酮可通过改善小鼠脑内睡眠相关神经递质而发挥镇静作用；协同戊巴比妥钠睡眠试验证实了药食同源的百合具有镇静催眠作用[7-8];五味子中的标志性成分五味子醇甲对正常小鼠具有剂量依赖性的镇静催眠作用，还可延长戊巴比妥诱导小鼠的睡眠时间[9]。但未见有蛹虫草、五味子、百合联合应用相关的镇静催眠复方研究。复方蛹虫草口服液为本研究团队以传统中医药理论及临床经验为指导，由蛹虫草、五味子、百合组方，从药理、毒理学角度对CCMOL进行镇静催眠作用机制及毒理学考察，以期为CCMOL作为镇静安神类中药及保健品开发提供理论基础和科学依据。

1、材料与仪器

1.1 主要试剂和试药

CCMOL,北华大学药学院药物化学研究室自制；戊巴比妥钠，北京化学试剂公司；地西泮，山东信谊制药有限公司；环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.2 主要仪器

YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪，成都泰盟科技有限公司；Infinite M200型酶标仪，瑞士Tecan 集团；FSH-2型高速匀浆机，江苏省金坛亿通电子有限公司；Allegra X-22自动平衡微型离心机，美国Beckman coulter公司；SPX-250B-Z生化培养箱，上海博远实业有限公司。

1.3 试验动物

SPF级ICR小鼠(SCXK(吉)-2020-0002),体质量(20±2)g, 饲养环境温度20～24 ℃,相对湿度控制在40%～60%。

2、方法

2.1 小鼠自主活动试验

将雄性ICR失眠模型小鼠(腹腔注射PCPA混悬液300 mg/kg, 连续注射2 d)随机分为模型组，阳性药组，CCMOL低、中、高剂量组(分别为3、15、30 mL/kg),另取10只正常小鼠作为空白对照组。除阳性药组外，其他各组均连续灌胃14 d, 阳性药组于第14天灌胃给予地西泮3 mg/kg。于第14天给药后40 min, 测定并记录试验小鼠5 min 内自主活动次数。

2.2 CCMOL协同阈下剂量戊巴比妥钠睡眠试验

试验方法与2.1相同，第14天灌胃后40 min, 所有小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠28 mg/kg, 记录翻正反射消失 1 min以上的小鼠数量，并计算入睡率：入睡率=(小鼠入睡只数/小鼠总数)×100%。

2.3 CCMOL协同阈剂量戊巴比妥钠睡眠试验

试验方法与2.1相同，第14天灌胃后40 min, 所有小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠55 mg/kg, 记录试验小鼠入睡潜伏期和睡眠时间。

2.4 急性经口毒性试验

选取20只ICR小鼠，雌、雄各半，按最大耐受量法，设67 mL/kg(相当于人体推荐量的200倍)1个剂量组，临用前按5:1比例浓缩，即相当于1次灌胃给予CCMOL 13.4 mL/kg。灌胃后正常饲养2周，观察小鼠每天的死亡、中毒和一般状态。

2.5 骨髓细胞微核试验

选取50只ICR小鼠，分为30、15、3 mL/kg CCMOL给药组，阴性对照组(蒸馏水),阳性对照组(40 mg/kg环磷酰胺),每组10只，雌、雄各半。采用30 h两次灌胃法灌胃，每只小鼠观察嗜多染红细胞1 000个，记录有微核的嗜多染红细胞，并计算微核发生率。

2.6 精子畸形试验

取ICR小鼠50只，均为雄性，分为30、15、3 mL/kg的CCMOL给药组，阴性对照组(蒸馏水),阳性对照组(40 mg/kg环磷酰胺),10只/组，灌胃5 d, 1次/d。于灌胃后的第35天处死小鼠，取其附睾，制片、染色，计数每只小鼠结构完整的5 000个精子，并计算精子畸变发生率。

2.7 细菌回复突变(Ames)试验

在加/不加S9混合液条件下，取TA102、TA100、TA97和TA98 菌株分别对5 000、2 500、1 250、625、312.5 μL/皿 5个CCMOL剂量组进行平板掺入法Ames试验。各菌株每剂量做3个平行皿，培养48 h, 记录各皿中回变菌落数量。

2.8 统计学分析

应用SPSS 17.0对数据进行处理与统计学分析。计量资料以均数±标准差

表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

3、结果

3.1 CCMOL的镇静催眠作用

本研究结果显示，模型组小鼠的入睡率为0,与对照组比较，模型组小鼠自主活动次数明显增加(P<0.01),睡眠时间显著缩短(P<0.01),入睡潜伏期也显著延长(P<0.01)。各CCMOL剂量组小鼠的自主活动次数、入睡潜伏期及睡眠时间与模型组比较差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),入睡率也随着CCMOL剂量的增加而升高，其中，30 mL/kg组的入睡率可达80%,表明CCMOL具有较好的镇静催眠活性，见表1。

表1 CCMOL对小鼠自主活动及入睡率的影响

3.2 急性经口毒性试验结果

本研究结果显示，在14 d观察中，20只小鼠活动及毛色均正常，未见中毒症状，死亡数为0。第14天观察一般状态后处死小鼠，解剖后肉眼观察脏器情况，均未见异常。急性经口试验结果表明，雌、雄小鼠经口最大耐受剂量(TMD)均大于人体推荐量的200倍，相当于67 g/kg生药量，即67 mL/kg。按照保健食品相关毒理学原则中的急性毒性分级标准，CCMOL急性毒性分级属无毒级。

3.3 骨髓细胞微核试验结果

本研究结果显示，与阴性对照组比较，环磷酰胺组的噬多染红细胞(PCE)微核率差异具有统计学意义(P<0.01),显示出强烈的致突变作用。而3个CCMOL剂量组的差异均无统计学意义(P>0.05),表明在本试验剂量下，CCMOL的骨髓细胞微核试验结果为阴性，见表2。

3.4 小鼠精子畸形试验结果

本研究结果显示，与阳性对照组比较，阳性对照-环磷酰胺组小鼠的精子发生了显著畸变(P<0.01),而3个CCMOL剂量组比较差异均无统计学意义(P>0.05),但与阳性对照-环磷酰胺组小鼠比较差异具有统计学意义(P<0.01),表明CCMOL在本试验剂量下不会诱发精子畸形。

表2 小鼠骨髓细胞微核试验结果

表3 小鼠精子畸形试验结果

3.5 Ames试验结果

在加/不加S9条件下，阳性对照组的菌株回变菌落数超过了自然回变组的2倍以上，而CCMOL不同剂量组的菌株回变菌落数与自然回变组、溶剂对照组一样均在正常范围内；Ames试验结果为阴性，表明CCMOL对鼠伤寒沙门氏菌无直接或间接致突变作用。

4、结论

蛹虫草为我国新资源食品之一，其味甘、性平，入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，是能同时平衡、调节阴阳的中药，与我国中医理论中“阴阳平衡即健康”和“辨证施治”的理念具有一致性[10]。蛹虫草与我国传统名贵中药材冬虫夏草互为同属异种，但冬虫夏草价格昂贵，来源有限，大大限制了应用及产品开发。药理学研究[11]表明，蛹虫草与冬虫夏草所含成分相近，表现出相同的药理作用，含有多糖、腺苷、虫草素、黄酮等多种具有调节免疫力、抗肿瘤、镇静催眠、降血糖等功效成分[6,12-13]。因此，近年来，更多研发人员将目光聚焦于通过简单培养即可获得大量子实体的蛹虫草的研究上，本研究亦在前期确定了蛹虫草的镇静催眠作用及机制[6]。五味子[14-15]、百合[7,16-17]所含化学成分种类丰富、功效多样，且均为药食同源物品，食用安全性高、历史悠久，现代研究表明，二者也具有明确的镇静催眠作用。本研究中的复方蛹虫草口服液即是以此三味药食同源中药材合理组方，采用先进的提取、制剂技术制备而成。通过小鼠自主活动试验和戊巴比妥钠协同试验确定了CCMOL可显著抑制失眠小鼠的自主活动，且能延长睡眠时间，缩短入睡潜伏期，证实了CCMOL的镇静催眠作用效果良好。CCMOL的TMD值高于人体推荐剂量的200倍，3项常规的毒理学试验结果均为阴性，表明其安全、无毒，相较于具有宿醉、谵妄、共济失调等不良反应的苯二氮类西药镇静催眠药具有明显优势。

综上，CCMOL具有良好的镇静催眠活性，且安全无毒。本研究成果可为复方蛹虫草口服液作为改善睡眠的功能食品进一步开发应用提供理论基础和科学依据。

参考文献:

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