慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是各种原因引发的肾脏结构与功能障碍，病情呈进行性加重，早期治疗预后良好，延误治疗可能引发肾衰竭、尿毒症，严重者可能失去生命［1-2］。CKD逐渐成为威胁人类身体健康的安全问题，影响患者生活质量，大量细胞外基质在肾小球和肾间质沉积，通过肾小管上皮细胞、肌成纤维细胞和免疫细胞相互作用以及炎症加重参与CKD肾纤维化，而肾纤维化是CKD的重要病理表现［3］。M1型巨噬细胞极化增加促炎因子、自由基生成，还可通过调控Th1/Th17维持炎症，因此控制M1型巨噬细胞极化可能是阻止肾脏损伤的免疫方式［4］。MA等［5］研究显示，巨噬细胞内Notch信号通路激活促进肾脏炎症与纤维化。生信网站分析显示miR-532-3p与Notch1存在结合位点，且miR-532-3p参与肾脏炎症与纤维化进程［6］。因此猜测miR-532-3p可能通过调控Notch1通路影响肾脏纤维化与炎症，课题组将对此展开研究。

1、材料与方法

1. 1　材料　

75只SD大鼠［生产许可证号：SCXK（粤）2022-0064、使用许可证号：SYXK（粤）2022-0296］购自广东莱迪生物医药研究院有限公司，本研 究 经 海 南 省 人 民 医 院 医 学 伦 理 委 员 会 批 准（202109521）。腺嘌呤购自上海源叶生物科技有限公司；Notch1抑制剂FLI-06购自MedChemExpress公司；HEK293 T细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；HE染色试剂盒、Masson染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；ago-NC、ago-miR-532-3p由上海生工提供；血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、TNF-α、IL-1β、IL10 ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；兔抗鼠Notch1、GAPDH、羊抗兔二抗购自美国Ab‐cam公司；显微镜购自美国BRUKER；蛋白电泳仪购自北京君意华鑫；半干转膜仪购自美国Hoefer；凝胶成像仪购自法国Vilber；流式细胞仪购自美国BD。

1. 2　方法　

1. 2. 1　动物造模及分组　

随机选取60只大鼠进行造模，灌胃含腺嘌呤（250 mg/kg）的混悬液及1. 2%高磷饲料4周，5~8周腺嘌呤隔日灌胃。另取15只大鼠作为对照组，喂食普通饲料并灌胃等量生理盐水，连续8周［7］。造模成功大鼠随机分为CKD组、ago-NC组、ago-miR-532-3p组、FLI-06组。ago-miR532-3p组、ago-NC组分别尾静脉注射10 mg/kg agomiR-532-3p及其阴性对照ago-NC，FLI-06组腹腔注射3 mg/kg FLI-06［8］，每周1次，持续12周。对照组与CKD组尾静脉注射、灌胃等量生理盐水。

1. 2. 2 Scr、BUN及炎症因子测定　

大鼠末次处理后麻醉，腹主动脉取血，离心得血清，按照ELISA试剂盒说明检测大鼠血清Scr、BUN、TNF-α、IL-1β、IL-10含量。

1. 2. 3　肾脏组织病理学观察　

各组随机取5只大鼠，取肾组织，10%中性甲醛固定，常规制定石蜡切片，常规脱蜡至水，HE染色试剂盒对大鼠肾组织进行染色，显微镜下观察肾组织病理。

1. 2. 4 Masson染 色 观 察

大 鼠 肾 脏 纤 维 化　 取1. 2. 3中的石蜡切片常规脱蜡至水，Weigert苏木精染色液染核7 min，水洗，Masson染色8 min，磷钼酸分化3 min，苯胺蓝染5 min，0. 2%冰乙酸浸洗，95%乙醇、无水乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察。

1. 2. 5　流式细胞术检测巨噬细胞CD11c+和CD206+蛋白表达　

各组随机取5只大鼠，将肾脏组织剪碎，制 备 单 细 胞 悬 液 ，离 心 得 沉 淀 ，重 悬 ，添 加PECD11c+、FITC-CD206染色30 min，染色缓冲液洗涤、4%多聚甲醛固定、100 µl 0. 1%皂素10 min破膜、PBS洗 涤 重 悬 后 转 至 流 式 管 ，流 式 细 胞 仪 检 测CD11c+和CD206+表达，分别代表M1型巨噬细胞与M2型巨噬细胞，并计算M1/M2。

1. 2. 6 qRT-PCR检测大鼠肾组织miR-532-3p水平　

取每组剩余5只大鼠肾组织，Trizol法提取总RNA后检测纯度和浓度，反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，进行qRT-PCR扩增（n=5），反应体系（50 µl）：2×Phanta Max buffer 25 µl、正反向引物各2 µl、dNTP Mix 1 µl、Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1 µl、cDNA 5 µl、DEPCS水14 µl；程序设定：94℃预变性10 min，94℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，循环35次，2−∆∆Ct计算miR-532-3p相对表达（U6为内参），引物见表1。

1. 2. 7 Western blot检测大鼠肾组织Notch1蛋白表达　

取1. 2. 6中剩余肾组织，提取总蛋白，BCA定量，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，封闭2 h，加入一抗Notch1（1∶1 000稀释）、GAPDH（1∶5 000稀释）4℃孵育过夜，室温下与HRP偶联的羊抗兔二抗孵育1 h，增强型化学发光试剂盒可视化蛋白，Image J软件分析目的蛋白灰度值。

1. 2. 8　双荧光素酶鉴定靶向关系　

构建Notch1野生 型（WT）与 突 变 型（MUT）质 粒 ，分 别 作 为WTNotch1、MUT Notch1，与mimic NC、miR-532-3p mimic分别共转染至HEK293 T细胞，分别作为mimicsNC+WT Notch1组 、miR-532-3p mimics+WT Notch1组、mimics NC+MUT Notch1组、miR-532-3p mimics+MUT Notch1组，双荧光素酶试剂盒测定各组荧光素酶活性 。Western blot检测miR-532-3p过表达对Notch1蛋白表达的影响（mimic NC组、miR-532-3pmimic组）。

1. 3　统计学方法　

采用SPSS21. 0软件进行统计分析，计量资料采用xˉ±s描述，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验，P<0. 05为差异有统计学意义。

2、结果

2. 1　各组大鼠血清Scr、BUN水平比较　

与对照组相 比 ，CKD组 大 鼠 血 清Scr、BUN水 平 升 高（P<0. 05）；与CKD组相比，ago-miR-532-3p组、FLI-06组大鼠血清Scr、BUN水平降低（P<0. 05，表2）。

2. 2　各组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-10水平比较　

与对照组相比，CKD组大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平升高，IL-10水平降低（P<0. 05）；与CKD组相比，agomiR-532-3p组、FLI-06组大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平降低，IL-10水平升高（P<0. 05，表3）。

2. 3　各组大鼠肾组织病理学比较　

对照组大鼠肾小球、肾小管及上皮细胞结构完整，胞界清晰，排列整齐；CKD组大鼠肾小球上皮细胞坏死增多、系膜基质增多、肾小球硬化，炎症细胞浸润；与CKD组相比，ago-miR-532-3p组、FLI-06组肾小球、肾小管损伤程度减轻，炎症浸润细胞减少（图1）。2

. 4　各组大鼠肾组织纤维化观察　

对照组大鼠可见管状基底膜，未见胶原纤维增殖；CKD组大鼠肾间质可见大量染色，间质纤维组织呈束状或网状增生；与CKD组相比，ago-miR-532-3p组、FLI-06组大鼠肾纤维化程度减轻（图2）。

2. 5　各组大鼠肾组织巨噬细胞CD11c+和CD206+表达比较　

与对照组相比，CKD组大鼠肾组织巨噬细胞CD11c+比例、CD11c+/CD206+升高，CD206+降低（P<0. 05）；与CKD组相比，ago-miR-532-3p组、FLI06组大鼠肾组织巨噬细胞CD11c+比例、CD11c+/CD206+降低，CD206+升高（P<0. 05，表4、图3）。

表3　各组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-10水平比较

表1　引物序列

表2　各组大鼠Scr、BUN水平比较

图1　各组CKD大鼠肾脏病理观察

2. 6　各组大鼠肾组织miR-532-3p、Notch1蛋白表达比较　

与对照组相比，CKD组大鼠肾组织miR-532-3p水平降低，Notch1蛋白表达升高（P<0. 05）；与CKD组相比，ago-miR-532-3p组、FLI-06组大鼠肾组织miR-532-3p水平升高，Notch1蛋白表达降低（P<0. 05，表5、图4）。

图2　各组大鼠肾组织纤维化观察

表4　各 组 大 鼠 肾 组 织

图3　各组大鼠巨噬细胞M1/M2极化流式细胞图

2. 7 miR-532-3p靶向Notch1 Starbase网站预测

miR-532-3p与Notch1具有结合位点（图5），双荧光素酶实验显示，各组差异有统计学意义（F=55. 958，P<0. 05），miR-532-3p mimics+WT Notch1组荧光素酶活性低于mimics NC+WT Notch1组（0. 24±0. 03vs 1. 02±0. 15，P<0. 05），miR-532-3p mimics+MUTNotch1组与mimics NC+MUT Notch1组荧光素酶活性差异无统计学意义（0. 98±0. 14 vs 1. 01±0. 14，P>0. 05）。与mimic NC组相比，miR-532-3p mimic组Notch1蛋白表达降低（0. 82±0. 08 vs 1. 41±0. 13，t=4. 661，P<0. 05，图6）。

表5　各组大鼠肾组织miR-532-3p、Notch1水平比较

图4　各组大鼠肾组织Notch1蛋白表达

图5 Starbase网站预测miR-532-3p与Notch1的结合位点

图6 miR-532-3p过表达对Notch1蛋白的影响

3、讨论

CKD是进行性肾结构与功能损伤性疾病，可发展为尿毒症及死亡，严重威胁患者生命及生活质量。巨噬细胞极化在CKD发展中发挥作用，M1型巨噬细胞可通过释放IL-6、TNF-α 等细胞因子发挥促炎作用，炎症促进肾纤维化进展，导致肾结构与功能损失。CKD早期存在免疫失衡，组织损伤处促炎因子发挥防御作用，驱使巨噬细胞活化，研究认为肾损伤与炎症互相增强［9-11］。M1型巨噬细胞还可调节Th1/Th17平衡参与免疫调控。M2型巨噬细胞分泌抗炎因子促进伤口愈合与组织重塑［12］。因此M1/M2巨噬细胞不平衡参与CKD进展，M1/M2巨噬细胞极化在体内的表现及机制仍需进一步探讨，分析分子调控机制有助于靶向诱导巨噬细胞极化，为CKD治疗提供新方式。目前miR-532-3p研究多集中于肿瘤领域，在肺癌、结直肠癌中呈低表达［13-14］。王春阳等［15］研究显示，缺血后处理后，大鼠肾脏miR-532-3p水平升高，可能参与减弱肾缺血再灌注损伤的作用机制。此外miR-532-3p在调控炎症免疫方面发挥作用。本研究中CKD大鼠肾纤维化、肾损伤严重，CD11c+、CD206+分别为M1型、M2型巨噬细胞标志物，本研究中M1型占比增加，M1/M2升高，细胞因子TNF-α、IL-1β 水平升高，IL-10水平降低，提示CKD出现炎症极化与肾损伤，佐证了CKD大鼠巨噬细胞向M1偏移，提示miR-532-3p可能在CKD中发挥作用，但两个标志物确定巨噬细胞两种亚型的误差较大，可能对结果造成一定影响。促进大鼠miR-532-3p表达后，大鼠肾损伤与肾纤维化水平降低，提示miR532-3p可能发挥CKD大鼠肾保护作用。大鼠M1型巨噬细胞占比以及M1/M2下降提示促进miR-532-3p表达可减少CKD大鼠炎症极化。为解释miR-532-3p调控巨噬细胞极化的机制，本研究通过分析miR-532-3p的下游调控通路发现Notch1与miR-532-3p存在结合位点，双荧光素酶报告基因显示miR-532-3p与Notch1靶向结合，并从蛋白层面验证了miR-532-3p可靶向调控Notch1蛋白。Notch1通路在CKD中的作用有大量研究。沈育丽［16］研究显示，高尿酸血症诱导的CKD中存在Notch通路激活，在肾间质纤维化中扮演重要角色，特异性阻断Notch信号通路可保护肾组织；刘兴梅等［17］研究显示，Notch可抑制自噬促进糖尿病小鼠肾小管间质纤维化；MA等［5］研究显示，巨噬细胞中Notch过度激活可促进肾脏炎症、纤维化与坏死。

本研究Notch1抑制剂可发挥与miR-532-3p过表达同样的作用，保护肾组织，降低肾组织炎症反应，诱导M1/M2极化向M2偏移。也有研究人员关注Notch与巨噬细胞的关系，如HUANG等［18］研究发现，Notch参与弥漫性B细胞淋巴瘤巨噬细胞极化；李娜等［19］研究发现，Notch参与脉络膜新生血管中巨噬细胞极化表型与功能调控；巨噬细胞极化在心肌纤维化进程中存在Notch激活［20］。因此本研究猜测促进miR532-3p表达通过抑制Notch1通路保护肾组织可能与调控巨噬细胞极化有关。

综上，促进miR-532-3p表达通过抑制Notch1通路保护CKD大鼠肾组织，其机制可能是调控巨噬细胞极化。本研究也存在一定不足，未进行回复实验验证miR-532-3p调控Notch1的机制，无法排除miR532-3p对其他信号通路的影响，有待进一步证明。

参考文献:

[4]杨 帆,童婧涵,李 会,等. BTK抑制剂GDC-0853通过TLR4/NF-κB通路抑制M1巨噬细胞极化并改善UUO肾损伤[J].免疫学杂志,2021,37(2):107-114.

[7]石凯峰,张 宁,柳诗意,等.补肾活血方通过调节Bcl-2/Bax凋亡相关蛋白对慢性肾脏病大鼠血管钙化的影响[J].中华中医药杂志,2017,32(5):2188-2193.

[8]李博伟,李 霄,张卓超,等. Notch-Hif-1α信号通路参与调控大鼠肝再生过程的研究[J].现代生物医学进展,2016,16(15):2806-2810.

基金资助:海南省自然科学基金(822MS169);

文章来源:徐明芝,安娜,白亚飞,等.miR-532-3p靶向抑制Notch1信号通路对慢性肾脏病大鼠巨噬细胞极化的影响[J].中国免疫学杂志,2025,41(02):310-314+319.