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赛拉嗪残留引起两起食物中毒的液质联用检测分析

2023-07-12 124 上传者：管理员

摘要：采用靶向筛查兽药应急检测方法，对2起疑似食用市售熟牛肉、熟鹿肉等肉类制品引起的中毒事件进行实验室检测分析，为中毒事件的快速处置和患者的及时救治提供数据支持。方法利用液相色谱-离子阱质谱(4000 QTRAP)的“杆-阱”扫描模式(MRM-IDA-EPI)建立中毒食物样本及生物样品中赛拉嗪等14种兽药的应急检测方法，并对现场采集的生、熟肉类样品和医院提供的患者生物样品进行快速定性和定量分析。结果采用实验室建立的检测方法分析了2020年—2021年发生的2起中毒事件，结果从熟牛肉、生鹿肉、熟鹿肉和患者的生物样本中筛查出引起食物中毒的化合物赛拉嗪。结论结合2起中毒事件的流行病学调查内容和实验室检测结果分析，可以判定这2起事件均是由含有赛拉嗪的动物源性食品引起的食物中毒事件。实验室建立准确、简便、快速的检测方法，可用于食物中毒事件的确证分析。

关键词：
兽药
液相色谱-线性离子阱质谱法
赛拉嗪
靶向筛查
食物中毒
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兽药广泛应用于牲畜养殖的每一个环节，合理的使用兽药可以有效降低牲畜病害，降低养殖成本，提高养殖效率。违规使用兽药则对食品安全造成了很大隐患，近年来由于违规使用兽药引起中毒事故屡见不鲜[1,2,3,4]。2020年6月9日13时宁夏银川市贺兰县，5名消费者在某面馆就餐后陆续出现嗜睡等神经系统症状。就医期间，患者的生化结果显示为低钾血症，其他检验结果均正常，医院初步诊断为食物中毒待排查。随即，某县疾病预防控制中心调查人员将现场采集的熟制牛肉样本及店内未加工的生牛肉样本，以及医院提供的患者生物样本送至自治区疾病预防控制中心开展毒物筛查工作。2021年8月5日19时宁夏中卫市，李某于家对面的某鹿肉餐馆内购买了1份清炖鹿肉回到家与家人共同食用。5人均于就餐后半小时出现口干、头晕、嗜睡症状，当晚未引起重视，均未就诊。8月6日早上5人不适症状未减轻，遂至医院就诊。8月6日下午疾病预防控制中心调查人员在事发餐馆内采集生、熟鹿肉各1份，以及医院提供的患者血液样本送至自治区疾病预防控制中心开展毒物筛查工作。实验室通过已建立的“杆-阱”扫描质谱数据库(MRM-IDA-EPI)对2次事件中的样品进行靶向筛查和定量分析，结果在熟牛肉、生鹿肉、熟鹿肉、患者的血液和尿液中均检测出兽用麻醉药—赛拉嗪。结合流行病学调查报告，确证这2次事件均是由违规使用兽药赛拉嗪引起的食物中毒事件。

1、材料与方法

1.1材料

2020年6月9日，于银川市患者就餐的牛肉面馆后厨采集生牛肉1份，患者食用的同批次熟牛肉1份，于患者就诊的医院分别采集5例的患者中毒当日静脉血液5份、尿液5份，共计12份。2021年8月6日16时，于中卫市某餐馆内采集生鹿肉1份、熟鹿肉1份，于患者就诊的医院分别采集4例患者中毒当日静脉血液4份，共计6份。

1.2仪器与试剂

LC-20AD超快速液相色谱仪(日本Shimadzu);4000 QTRAP线性离子阱系统(美国AB Sciex);3-30K高速冷冻离心机(瑞士Sigma)。14种兽药混合标准品(编号：1ST47178-100MD;浓度：100μg/ml;规格：1 ml);甲醇、乙腈(色谱纯);DisQuETM脱水剂(6.0 g硫酸镁/1.5 g乙酸钠)。实验用水均为超纯水(18.2 MΩ/cm),由美国Millipore超纯水仪制备。

1.3方法

1.3.1前处理方法

生、熟肉类样品：经均质仪器均质后，称取2.0 g样品(精确至0.01 g)于15 ml离心管，加入10 ml甲醇-水(50:50,V/V),振荡提取15 min, 9 500 r/min离心5 min,取100μl提取液，用超纯水定容至1 ml,经0.22μm微孔滤膜后，用LC-MS/MS分析。尿液：取1.0 ml尿液，经0.22μm微孔滤膜过滤除去杂质，直接用于LC-MS/MS分析。血液：取2.0 ml全血于15 ml离心管中，加入1 ml乙腈，涡旋混匀1 min,加入1 g脱水试剂，振荡提取10 min, 9 500 r/min离心5 min,取100μl提取液，用超纯水定容至1 ml,经0.22μm微孔滤膜后，用LC-MS/MS分析[11,12]。

1.3.2色谱条件

色谱柱：Ultimate PFP柱(2.1 mm×100 mm, 3μm);柱温：40℃;流速：0.3 ml/min,进样体积：10μl;流动相A:0.1%甲酸水，流动相B:乙腈；梯度洗脱程序：0.50 min～3.50 min,流动相B:10%;3.50 min～6.50 min,流动相B:90%;6.50 min～8.50 min,流动相B:10%;8.50 min～10.00 min,流动相B:10%。

1.3.3质谱条件

电离源：电喷雾离子源(ESI),电离方式：正离子模式(ESI+);检测方式：多反应监测(MRM);电喷雾电压：5 500 V;离子源温度：550℃;气帘气(CUR):20 Psi;雾化气(GAS1):40 Psi;辅助气(GAS2):40 psi; 14种兽药CAS号、保留时间、母离子、定性定量离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)如表1所示。

表1 14种兽药的质谱参数

1.3.4 MRM-IDA-EPI参数

智能信息相关采集(IDA):动态背景扣除，不排除前级扫描过的离子，扫描强度阀值为1 000 cps;增强子离子扫描(EPI):扫描范围为50 m/z～300 m/z,扫描速率为4 000 Da/s, DP, CE和CES分别为80 V,30 eV和15 eV,离子源等其他质谱参数同MRM模式。

2、结果

2.1靶向筛查

采用LC-MS/MS分别对2次中毒事件中生、熟肉类和患者的血液和尿液中14种药物进行了靶向筛查分析。经测定，2020年6月9日在银川市采集的12份中毒样品中，熟牛肉、所有患者血液和尿液中均检出赛拉嗪，其余13种兽药均未检出；生牛肉中未检出任何14种兽药；2021年8月5日在中卫市采集的6份中毒样品中，生、鹿肉熟及患者的血液中均检出赛拉嗪，其余13种兽药均未检出(图1)。在定性分析中，首先，阳性样品溶液中可疑目标物的保留时间与赛拉嗪标准溶液一致，符合偏差<5%的要求[5]。其次，阳性样品溶液中可疑目标物和赛拉嗪标准溶液的相对离子丰度的相对偏差分别为-2.8%～20%,均在规定的允许的相对偏差±40%之内[5]。由此可知，采用传统MRM模式，可通过保留时间和相对离子丰度对赛拉嗪进行定性分析。在传统MRM操作的基础上，采用MRM-IDA-EPI模式对目标物进行确证分析。首先，赛拉嗪标准溶液(80 ng/ml)产生的母离子[M+H]+=220.6,主要特征碎片离子164.1、147.2和90.0等；其次，在相同参数下，熟牛肉和患者生物样本中可疑目标物的母离子[M+H]+=221.0,主要特征离子碎片为164.2、147.1和90.0等。通过质谱数据库检索对比发现，高质量的MS2图匹配度≥90%,排除假阳性样本的可能性，进一步确证引起中毒的化合物是赛拉嗪。

2.2定量分析

在定量分析中，14种兽药于生、熟肉类中检出限(LOD)值为2.5μg/kg,血液中LOD值为2.5 ng/ml,尿液中LOD值为0.5 ng/ml。经测定分析，2020年6月9日在银川市采集的12份中毒样品中熟牛肉中赛拉嗪含量为440.0μg/kg, 5例患者血液和尿液中赛拉嗪的含量分别为4.8 ng/ml～11.3 ng/ml和6.7 ng/ml～218.1 ng/ml; 2021年8月5日在中卫市采集的6份中毒样品中生鹿肉中赛拉嗪含量为193.0μg/kg,熟鹿肉中赛拉嗪含量为5.0 mg/kg, 4例患者的血液中赛拉嗪含量为8.6 ng/ml～46.8 ng/ml

图1总离子流图

注：A.赛拉嗪标准溶液；B.患者尿液中的赛拉嗪；C.患者血液中的赛拉嗪；D.熟牛肉中的赛拉嗪；E.生鹿肉中的赛拉嗪；F.熟鹿肉中的赛拉嗪。

3、讨论

赛拉嗪又名甲苯噻嗪，是一种高效的α2-肾上腺素兴奋剂，具有松弛局部肌肉或者进行局部麻醉等作用，经常作为兽用镇静止痛剂鹿眠灵的主要成分之一。目前，国家标准《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》(GB 31650—2019)已明确规定赛拉嗪可作为治疗使用，但不得在动物性食品中检出[6]。然而，在我国违规使用兽药赛拉嗪污染动物源性食品并造成消费者中毒的情况时有发生[1,2,3]。误食含有赛拉嗪的动物源性食品可能会造成消费者出现头晕、乏力、心悸、胸闷、口干、意识障碍、瞳孔缩小、心动过缓、低血压和呼吸抑制等临床症状[7]。现代医学研究表明，赛拉嗪在人体内吸收后可迅速代谢成2,6-二甲基苯胺，仅有8%的原药会通过尿液排出，10 h～15 h内排泄完全[8]。

在2020年6月9日发生的中毒事件中，5例患者于进餐约15 min后，陆续出现嗜睡、头晕、口干舌燥、乏力等症状，其中1人伴有呕吐、2人伴有口唇发绀，5人均无腹痛、腹泻及发热症状。病例中最早发病为当日13时25分，最晚发病为当日13时50分；最短潜伏期15 min,最长潜伏期40 min,平均潜伏期25 min。在2021年8月5日发生的中毒事件中，5例患者在进餐约30 min后陆续出现口干、嗜睡、头晕、乏力等症状，其中2人嗜睡症状较严重。5例患者最短潜伏期为0.5 h,最长潜伏期为1 h,平均潜伏期为0.75 h。结合2次中毒事件的流行病学调查内容和实验室对中毒事件中采集样本的定性、定量分析，可以判定这2起事件均是由含有赛拉嗪的动物源性食品引起的食物中毒事件。有文献研究表明，对牛注射5倍使用剂量的赛拉嗪后进行屠宰，并立即检测，在注射部位检出赛拉嗪，将牛肉煮熟后再次检测仍能检测出高浓度的赛拉嗪[9]。由此可见，赛拉嗪热稳定性较好，高温烹煮无法有效去除肉类中残留的赛拉嗪。这些含有兽药赛拉嗪残留的肉类流入市场，使消费者食用后出现中毒反应。

在肉类制品中兽药赛拉嗪的常规检测工作中，一般参考《猪肾和肌肉组织中乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安残留量的测定液相色谱-串联质谱法》(GB/T 20763—2006)[10]。该方法提取时间长，过程复杂，所用试剂种类较多，难以满足中毒事件快速处置的要求。在两次赛拉嗪中毒事件的处置过程中实验室结合相关文献[11,12,13]和近几年应急中毒检测经验[14,15],采用了更易得的提取试剂和快速便捷的前处理方式，建立了适用于不同基质的检测方法和MRM-IDA-EPI质谱数据库，实现了对中毒事件中目标物的靶向筛查和确证分析，也为患者的及时救治起到了决定性的作用。

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