慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)是由各种原因引起的持续3个月以上的肾功能损害，其特征为进行性和不可逆的肾单位丢失、微血管损伤、肾脏再生能力减退、氧化应激状态、代谢紊乱以及炎症反应，最终导致肾小管间质纤维化和肾小球硬化[1]。全球范围内，CKD的发病率呈持续上升趋势，患者人数已超过8.5亿[2,3]。慢性肾功能衰竭(chronic renal failure, CRF)是各种慢性肾脏疾病持续进展的结果，主要临床表现为代谢产物滞留、水、电解质及酸碱平衡紊乱[4]。由于CRF起病隐匿，早期诊断困难，且治愈机会甚微，故被称为“沉默的杀手”。CRF的治疗目标是延缓肾功能恶化，预防相关并发症，并促进患者达到最佳的生理和心理状态[5,6]。目前，临床治疗手段主要包括药物治疗、透析(血液透析和腹膜透析)以及肾移植。其中，透析和肾移植治疗成本高昂，肾源稀缺，给大多数患者带来沉重的经济负担。因此，对于早中期CRF患者，药物治疗成为延缓病程进展的主要选择。

中医药在早期预防和延缓肾功能损害方面，显示出了独特的优势与潜力。李培旭主任中医师经过多年临证经验积累，提出补肾化浊祛瘀的治法，并形成了由人参、豆蔻、大黄、川芎、杜仲、石菖蒲、藿香、牡蛎、枸杞子等药物组成的复方制剂——肾衰胶囊[7]。方中人参大补元气、生津安神、补脾益肺为君；大黄通腑泻浊，牡蛎软坚散结、收敛固涩，川芎活血行气止痛共为臣；豆蔻温中行气，石菖蒲合用藿香醒脾化湿止呕，杜仲合用枸杞子补肝肾、强筋骨、益精血共为佐使[8]。经过长期临床观察，肾衰胶囊治疗CRF尤其是早中期患者具有显著疗效。其在降低血肌酐、尿素氮水平，改善肾性贫血等方面具有积极作用，提示肾衰胶囊可改善肾功能，具有延缓或部分逆转CRF进程等作用[9]。但肾衰胶囊治疗CRF的作用靶点和具体机制尚不明确。

网络药理学是一种基于系统生物学原理，在靶点、药物与疾病之间建立联系的技术，旨在全面评价多组分、多靶点药物的药理作用。网络药理学的核心思想与中医学的整体观念有着共通之处，因此广泛应用于中医药研究[10,11,12,13,14]。近年来，运用网络药理学技术将中药的有效成分、作用靶点及相应疾病整合为“成分-靶点-疾病”网络，成为分析中药有效成分和治疗靶点的重要工具[11,12,13]。分子对接作为一种广泛使用的虚拟筛选方法，能够揭示配体与受体的结合模式，预测分子与蛋白质间的结合亲和力[12,15],为阐释中医药的疗效提供了着眼点和有效工具。在筛选中药活性成分、靶点验证、理论解释、药物功能定位以及毒性评价方面，分子对接技术发挥着重要作用[16]。目前，网络药理学和分子对接技术已被广泛应用于探索中医药治疗各类疾病的活性成分和作用机制[17,18,19]。基于此，本研究运用网络药理学探析肾衰胶囊和CKD的活性成分、作用靶点，并通过分子对接进行初步验证，以期为CRF的临床治疗提供新思路。

1、材料与方法

1.1 肾衰胶囊活性成分筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)和BATMAN-TCM数据库检索肾衰胶囊组成药物的活性成分。其中，TCMSP的筛选条件为口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、类药性(drug likeness, DL)≥0.18,BATMAN-TCM的筛选条件为Score cutoff>20、Adjusted P-value<0.05。

1.2 肾衰胶囊作用靶点预测

将肾衰胶囊的活性成分导入PubChem数据库以获取其SMILES结构式，并于SwissADME平台预测其吸收、代谢等相关指标，遴选出胃肠道吸收(GI absorption)值为“HIGH”,且五种类药性原则(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)有2个及以上Yes的化合物。将筛选后的活性成分SMILES结构式导入Swiss Target Prediction数据库,获取活性成分的作用靶点，物种设定为“Homo sapiens”,将靶点可能性由大到小排列，去除可能性为0的靶点，最终得到肾衰胶囊的作用靶点。

1.3 CRF疾病靶点筛选及肾衰胶囊治疗CRF潜在靶点预测

以“chronic renal failure”为关键词，从OMIM、TTD、GeneCards数据库中检索疾病靶点，其中GeneCards数据库的筛选条件为Relevance score≥10。将从以上3个数据库获取的靶点合并并删除重复项，作为CRF的潜在靶点。通过微生信平台获取肾衰胶囊与CRF的交集靶点，并绘制韦恩图，作为肾衰胶囊治疗CRF的潜在靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络构建

将肾衰胶囊与CRF的交集靶点导入STRING数据库,物种设置为“Homo sapiens”,最低交互分数设置为0.9,并删除孤立的节点，构建PPI网络，保存tsv格式的文件。通过Cytoscape 3.10.0软件可视化PPI网络，采用“CytoNCA”插件对PPI网络进行拓扑分析，并计算中介中心性(betweenness centrality, BC)、度值(degree centrality, DC)、紧密中心性(closeness centrality, CC)的参数阈值。将均高于BC、DC、CC参数阈值的靶点作为肾衰胶囊治疗CRF的核心靶点，并将结果按度值从大到小排序，选出前10个核心靶点。

1.5 基因本体(Gene Ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析

将肾衰胶囊与CRF的交集靶点导入DAVID数据库,进行GO功能和KEGG通路富集分析。物种设置为“Homo sapiens”,以P<0.05为条件筛选，分别获取生物过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)、细胞组成(cellular component, CC)和KEGG通路，并使用微生信平台绘制条形图和气泡图。

1.6 “疾病-药物-活性成分-靶点”网络构建

将药物、活性成分以及交集靶点导入Cytoscape 3.10.0软件，从而构建“疾病-药物-活性成分-靶点”网络，并进行相关拓扑分析，根据度值筛选肾衰胶囊治疗CRF的关键活性成分。

1.7 活性成分与核心靶点的分子对接验证

首先，通过“疾病-药物-活性成分-靶点”网络的拓扑分析以及查阅文献，筛选最终要进行分子对接的5个关键活性成分(配体)与8个核心靶点(受体)。然后，通过TCMSP数据库获得配体的mol2格式文件。利用RCSB PDB数据库(http: //www.rcsb.org/pdb)获得受体蛋白的3D结构，并使用PyMOL 2.6软件去除受体蛋白的水分子和小分子配体。利用AutoDock Tools 1.5.7软件进行分子对接，计算活性成分与核心靶点之间的最低结合能，结果导出为pdbqt格式文件。最后，利用Open Babel软件将文件转换为pdb格式，并通过Pymol 2.6软件对对接结果进行可视化展示。

2、结果

2.1 肾衰胶囊活性成分

通过TCMSP与BATMAN-TCM数据库获取肾衰胶囊的活性成分，其中枸杞子45个，豆蔻12个，大黄16个，川芎7个，杜仲28个，石菖蒲4个，藿香11个，牡蛎5个，人参22个。通过复筛后共保留78个活性成分。

2.2 肾衰胶囊治疗CRF的潜在靶点

通过Swiss Target Prediction数据库检索并筛选得到肾衰胶囊的作用靶点897个。从OMIM、TTD、GeneCards数据库中分别收集到CRF疾病靶点613个、3个、2 061个，合并去重后得到2 546个靶点。利用微生信平台绘制肾衰胶囊作用靶点与CRF疾病靶点的韦恩图，得到329个交集靶点，即为肾衰胶囊治疗CRF的潜在靶点，见图1。

图1 肾衰胶囊与CRF交集靶点韦恩图  

2.3 PPI网络及核心靶点

将329个交集靶点导入STRING数据库构建PPI网络，并用Cytoscape 3.10.0进行可视化处理，该网络包括267个节点和 1 006 条边，见图2。根据拓扑分析得出各项参数阈值，即BC=627.475 655 4,CC=0.050 382 6,DC=7.535 580 5,进一步筛选得到51个核心靶点。其中，度值排名前10位的核心靶点分别为STAT3、SRC、PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、PIK3CD、AKT1、ESR1、EP300、MAPK1,见表1。

图2 PPI网络图   

表1 度值排名前10位的核心靶点

2.4 GO和KEGG富集分析

将329个交集靶点导入DAVID数据库，得到1 196个BP、144个CC和269个MF,P值排名前10位的结果见图3。其中，BP主要包括对异生刺激的反应、蛋白质磷酸化、凋亡过程的负调节等，MF主要包括蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶、ATP结合等，CC主要包括细胞质膜、细胞表面、受体复合物等。KEGG富集分析共得到183条通路，主要包括PI3K-AKT信号通路、HIF-1信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、脂质和动脉粥样硬化等，P值排名前20位的结果见图4。

2.5 疾病-药物-活性成分-靶点网络

通过Cytoscape 3.10.0软件构建“疾病-药物-活性成分-靶点网络”,该网络包括366个节点和771条边，见图5。度值排名前10位的活性成分包括山柰酚、泽兰黄醇素、芫花素、杨梅酮等，这些成分可能是肾衰胶囊治疗CRF的关键活性成分，见表2。

图3 GO富集分析柱状图  

图4 KEGG富集分析气泡图   

图5 “疾病-药物-活性成分-靶点”网络图  

表2 度值排名前10位的活性成分

2.6 分子对接

一般来说，结合能<0意味着受体和配体自发结合，该值越低，两者的亲和力越大，结合能<-5 kcal·mol-1表明受体与配体具有较强的结合能力[20,21,22,23]。将5个关键活性成分山柰酚(Kaempferol)、泽兰黄醇素(Eupatin)、芫花素(Genkwanin)、杨梅酮(Myricanone)、高丽槐素(Inermin)与8个核心靶点ESR1(PDB ID:1A52)、SRC(PDB ID:7NG7)、EGFR(PDB ID:8A2A)、AKT1(PDB ID:7NH5)、PIK3R1(PDB ID:8DCP)、MAPK3(PDB ID:6GES)、JAK2(PDB ID:7JYQ)、STAT3(PDB ID:6NJS)进行分子对接分析。结果表明，肾衰胶囊关键活性成分与核心靶点均具有较强的亲和力和结合活性，其中山柰酚-AKT1的结合能为-8.46 kcal·mol-1,山柰酚-EGFR的结合能为-8.67 kcal·mol-1,杨梅酮-MAPK3的结合能为-9.27 kcal·mol-1,杨梅酮-AKT1的结合能为-9.59 kcal·mol-1,见图6、图7。

图6 分子对接结合能热图   

图7 分子对接可视化展示图  

3、讨论

CRF是指由各种因素引起的肾实质慢性、进行性损害，表现为肾脏萎缩和基本功能丧失，该病可影响各年龄段人群[5]。CRF的主要病理特征是肾小球硬化和肾间质纤维化，从而导致肾小球滤过率降低和肾脏排泄物质潴留[24]。肾纤维化的发病机制是成纤维细胞的过度活化和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的过量沉积，导致肾小管间质(即肾小管与周围毛细血管之间的区域)发生纤维化病变和瘢痕形成[25]。ECM沉积也是肾小球硬化的典型病理表现[26]。此外，炎性细胞因子可通过介导慢性炎症反应从而参与肾脏疾病的进展[27]。

本研究以肾衰胶囊为研究对象，筛选出山柰酚、泽兰黄醇素、芫花素、杨梅酮、高丽槐素等关键活性成分。山柰酚作为一种类黄酮化合物，具有抗炎、抗氧化应激及肾保护作用[28,29,30]。研究表明，山柰酚不仅能改善肾功能减退和肾间质纤维化，还能通过抑制STAT3激活，减轻炎症反应与氧化应激，进而改善肾小球硬化和肾间质纤维化，使其成为潜在的肾纤维化治疗候选药物[30,31]。芫花素可通过抑制炎症介质和相关信号通路从而发挥抗炎作用，其作为一种抗氧化剂，能够保护细胞免受氧化应激损伤。此外，芫花素通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡和阻碍血管新生等方式发挥抗癌活性，同时通过降低氧化应激、抑制神经炎症以及调节神经元信号通路发挥神经保护作用[32]。

AKT参与肾纤维化的进展，影响肾间质成纤维细胞、肾小球系膜细胞的增殖和活化[33]。研究表明，AKT1缺失可加重肾纤维化、肾小管细胞凋亡及肾小管去分化[34,35,36]。同时，在肾缺血再灌注损伤期间，AKT1缺失会加重肾小管凋亡和炎症反应[37]。分子对接结果亦提示，AKT1是活性成分的主要结合靶点，具有深入研究的价值。STAT3是STAT家族的重要成员之一，可介导细胞增殖和存活[38]。激活的STAT3形成二聚体并转移至细胞核，调节靶基因转录，同时对氧化还原平衡进行调控[39,40,41]。在单侧输尿管梗阻模型中，STAT3磷酸化介导肌成纤维细胞的活化和肾间质纤维化，表明STAT3信号传导可能与ECM积累有关[42,43]。EGFR是一种在肾脏中表达的酪氨酸激酶受体，在肾损伤后被激活。研究表明，EGFR信号通路激活与细胞增殖、炎症反应及ECM调节有关，这些均参与肾损伤的发生发展[44]。阻断EGFR对改善进行性肾脏疾病具有积极作用，尤其是肾纤维化[45,46]。此外，EGFR通路在肾脏生理、发育、组织修复及电解质平衡中起着至关重要的作用[47]。研究表明，激活SRC激酶可促进成纤维细胞活化和增殖，使肾小管细胞周期停滞并获得促纤维化表型，从而导致肾纤维化进展[48,49,50],而抑制SRC激酶可改善肾纤维化[51]。JAK2激活可促进多种疾病的进展，因此可通过抑制JAK2/STAT3信号传导，从而缓解肾小管间质纤维化[25,52]。ESR1、PIK3R1在肾脏纤维化过程中也发挥重要作用[38,53]。此外，MAPK3可调节肾脏疾病中涉及的关键细胞过程[54]。

KEGG分析结果中，PI3K/AKT信号通路和 HIF-1 信号通路是显著富集的通路。PI3K/AKT信号通路在调控人体细胞生长、发育等过程中发挥关键作用[55,56]。在肾纤维化进程中，该通路与炎症损伤、肾实质细胞凋亡、上皮细胞转分化以及间充质细胞(即成纤维细胞)增殖有关[26]。研究显示，PI3K/AKT信号轴的激活是器官纤维化的重要介质，与肾间质纤维化的发生发展紧密相关[57]。因此，抑制PI3K/AKT信号通路可能成为缓解肾间质纤维化和ECM积累的有效策略[58,59,60]。HIF-1是细胞调节缺氧适应性反应的主要因子之一[61]。研究表明，缺氧和氧化应激是导致各种肾脏损伤的关键因素[62,63],并在肾组织损伤、肾功能不可逆丧失以及肾纤维化进展中发挥重要作用[64,65,66]。

综上所述，肾衰胶囊中的山柰酚、芫花素等活性成分可通过靶向ESR1、SRC、EGFR、AKT1、PIK3R1、MAPK3、JAK2、STAT3等靶点，调控PI3K-AKT、HIF-1 等信号通路，从而发挥延缓肾纤维化、保护肾脏的作用。

本研究虽已探索肾衰胶囊治疗CRF的潜在作用靶点和信号通路，但仍存在一定的局限性。中药活性成分并非化合物的简单集合，肾衰胶囊的药效受其成分的浓度、含量以及相互作用等多重因素的影响。同时，当前用于整合药物靶点和成分信息的数据库尚无法全面揭示肾衰胶囊治疗CRF的药理机制。值得一提的是，任何科学假设的验证均需实验数据的有力支持。因此，将网络药理学预测结果与实验研究相结合是确认预测准确性和可靠性的关键步骤，这将为进一步开发中药新药提供坚实的科学依据。

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基金资助:河南省中医管理局首批中医拔尖人才培养项目{豫中医科教【2018】35};河南省中医药拔尖课题项目(2019ZYBJ26);河南省科技厅课题项目(212102311088);

文章来源:涂吉祥,唐桂军,郭泉滢,等.基于网络药理学和分子对接探讨肾衰胶囊治疗慢性肾功能衰竭的作用机制[J].中医学报,2024,39(06):1314-1322.