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生物信息学分析预测特应性皮炎与癫痫的潜在关联性

2024-09-12 44 上传者：管理员

摘要：目的探讨特应性皮炎与癫痫之间存在的潜在关联性。方法基因表达综合数据库(GEO)获取特应性皮炎数据集(GSE32924)和癫痫合并数据集(GSE28674和GSE143272)基因芯片结果，使用R语言筛选共有差异表达基因(DEGs)进行基因本体(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。在线平台已知和预测蛋白质相互作用数据库(STRING)和Cytoscape软件构建DEGs蛋白互作(PPI)网络，以连接度≥30为条件筛选核心基因。同时，利用分子复合检测(MCODE)插件挖掘PPI中有意义的模块(MCODE得分>3分，网络节点>4个)。结果两种疾病交集共获得90个DEGs,主要富集在氨基酸生物合成、神经鞘之类信号通路和精氨酸合成三大通路。从包含77个节点与456条连线的PPI中筛选得出2个具有意义的簇集模块，并以连接度≥30为筛选条件最终获得组织蛋白酶(CTS)D、人冠状蛋白(CORO1A)、核输出蛋白(XPO1)、含丝氨酸/苏氨酸激酶的PAS结构域(PASK)共4个核心基因。结论共有差异基因CTSD、CORO1A、XPO1、PASK的存在表明特应性皮炎和癫痫之间存在关联性，提示两者疾病之间可能存在共同分子机制。

关键词：
慢性炎症
特应性皮炎
生物信息学
癫痫
系统性疾病
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特应性皮炎(AD)是一种慢性炎症性皮肤疾病，发病率高，严重影响生活质量而造成患者心理负担[1,2]。研究表明，AD与多种全身系统性疾病之间存在密切关系，且其机制复杂。系统性疾病可能会促进AD的发生和发展，而AD也可能成为系统性疾病的潜在危险因素[3]。AD与精神神经系统性疾病的风险增加之间存在显著相关性[2,4]。癫痫(EP)是一种慢性反复发作的神经元信号异常传导的疾病，表现为EP发作[5],目前世界卫生组织已将EP列为重点防治的神经精神疾病之一。均被视为慢性炎症性疾病的AD和EP,已有研究结果提示，AD在内的过敏性疾病与EP之间存在关联性[6]。一项荟萃分析证实患有过敏性疾病的患者可能有较高的EP发生和发作风险[7]。另一项全美概况研究中Russ等[8]发现，既往包括AD在内过敏性疾病的患者EP发病率为43%,相较于无相关既往史者发病率26%具有显著差异。Chen等[6]发现，AD患者与后期EP发病风险增加相关联。然而，疾病之间的关联性的机制尚未阐明。本文将使用生物信息学分析AD与EP发病中共同参与的差异基因和其富集通路及核心共基因，并验证相关蛋白的表达。

1、材料和方法

1.1材料

人角质形成细胞(Hacat)由韩国首尔大学捐赠。胎牛血清购自美国Corning公司，重组肿瘤坏死因子(TNF)-α购自美国R&D公司。抗体核输出蛋白(XPO1)、人冠状蛋白(CORO1A)、含丝氨酸/苏氨酸激酶的PAS结构域(PASK)、组织蛋白酶(CTS)D均购自美国poteintech公司。山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G抗体和山羊抗鼠IgG抗体购自美国Santa Cruz公司。电化学发光(ECL)液购自中国Sloarbio公司。

1.2生物信息学分析

1.2.1数据获取与处理

所使用的疾病数据库(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)分别为GSE32924、GSE28674和GSE143272,其mRNA表达谱均从基因表达综合数据库(GEO,https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获取，各芯片所处平台依次为GPL6480 Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F、GPL570[HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Geno me U133 Plus 2.0 Array和GPL10558 Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip。在GSE32924提取8例正常皮肤组织和25例AD皮损处样本。同时，在GSE28674和GSE143272中分别提取18例伴或不伴早期具有复杂性热性惊厥病史的颞叶EP患者样本和50例正常样本与91例EP样本。

1.2.2数据前处理和差异表达基因(DEGs)的筛选

每个样本数据集的原始数据按Series Matrix File(s)格式下载，且相应的平台文件一同下载以便进行数据注释等后续使用。待完成数据注释后，合并GSE28674和GSE143272的样本数据再对其校正批次效应。随后，运用LIMMA包和SVA包执行数据前处理，包含背景校正、标准化、汇总和探针质量控制。筛选条件为P<0.05,|log2FoldChange(FC)|>0.3[9,10],上调基因满足log2 FoldChange(FC)>0.3,下调基因则属于log2FC<-0.3范围。筛选结果用火山图来绘制。

1.2.3绘制韦恩图和DEGs功能富集分析

从STRING数据库官方网站(http: //string-db.org/)中获取DEGs编码的蛋白质间潜在相互作用关系，并使用Cytoscape工具展示这些相互作用网络。随后，在Cytoscape中使用MCODE(Molecular Complex Detection)插件对蛋白质相互作用网络(PPI)进行分析，以MCODE得分>3分和网络节点数>4个为筛选条件，挖掘PPI网络中的有意义模块[11]。最后，利用CytoHubba插件筛选连接度≥30的核心基因[11]。

1.2.4 PPI、模块分析及核心基因的筛选

从STRING官方网站(http: //string-db.org/)中获取DEGs编码的蛋白质之间的潜在关系，使用Cytoscape呈现网络。此后，Cytoscape中使用MCODE插件对PPI进行再分析，以MCODE得分>3分，网络节点>4个为筛选条件挖掘PPI中有意义的模块[11]。最后，利用CytoHubba插件挑选连接度≥30的核心基因[11]。

1.3 Western印迹检测蛋白表达

在6孔板中每孔加入5×105/ml Hacat细胞，待细胞融合至60%～70%,将完全培养基更换为无胎牛血清的DMEM培养基12 h。12 h后正常组更换成正常培养基，处理组则利用10 ng/ml浓度的TNF-α处理Hacat细胞24 h后收集细胞，提取蛋白，测定蛋白浓度[二喹啉甲酸(BCA)法]。配制6%或8%胶、上样、电泳、转模、封闭，孵育对应的一抗(XPO1、CTSD、CORO1A、PASK)和二抗后ECL法显影。

1.4统计学处理

采用GraphpadPrism10软件进行t检验。

2、结果

2.1 DEGs筛选

在AD和EP依次得出共3 348个和446个DEGs,以火山图来呈现。见图1。最终，用韦恩图筛选出构成交集部分的90个DEGs。

图1 AD和Ep的DEGs筛选火山图

2.2 DEGs功能富集分析

基因本体(GO)分析显示生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组分(CC)各类别中选取满足P值<0.05且q值<1条件的结果。DEGs主要富集的BP依次为白细胞介导的细胞毒性、核质转运的调节、葡萄糖代谢过程的调节和脂质代谢过程的调节；CC为富含纤维胶原素-1颗粒、黑色素颗粒、自噬、凋亡；MF为磷脂酰肌醇3-激酶结合、核输出信号受体活性和蛋白C端结合。京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析结果表明，这些DEGs主要富集在氨基酸生物合成、神经鞘之类信号通路和精氨酸合成途径。见图2。

2.3 PPI分析、筛选集簇模块及核心基因的鉴定

通过STRING构建77个节456条连线的PPI(富集P值为5.16E-09),由CytoHubba分析并得出连接度≥30的4个差异核心基因，分别为CTSD(连接度=42),CORO1A(连接度=34),XPO1(连接度=34),PASK(连接度=30)。见图3。再由MCODE插件进行PPI分析，筛选出两个具有意义的簇集模块。见图4。

图2 DEGs的GO分析和KEGG

图3 PPI

图4有意义的簇集模块和核心基因

2.4 CTSD、CORO1A、XPO1和PASK在细胞中的表达水平

与正常组相比，处理组XPO1、CORO1A和PASK蛋白表达均显著升高，CTSD蛋白表达显著降低(均P<0.05)。见表1、图5。

表1两组PASK、CORO1A、CTSD、XPO1蛋白表达对比

图5两组PASK、CORO1A、CTSD、XPO1蛋白表达

3、讨论

研究表明，AD以Th2/Th22为中心伴有Th17和Th1的过度激活，其中，急性期以Th17相关信号增加为主，慢性期是Th2/Th22,Th17信号加强的基础上还有Th1的参与[12]。EP是一种与神经行为结果相关的慢性脑部疾病，由于炎症可以激活神经元和非神经元脑细胞的各种脑损伤，其启动一系列炎症事件。特异性炎症介质和免疫细胞在EP发作的发生与复发及相关的神经病理学和并发症中，扮演了重要的角色[13]。

CTSD作为一种天冬氨酸内切蛋白酶，广泛分布于溶酶体中。研究认为，在EP持续状态中CTSD和半胱氨酸蛋白酶在小胶质细胞明显升高，抑制CTSD在内的促凋亡因子将是有效的神经保护策略[14]。研究表明，CTSD被酸性鞘磷脂酶衍生的神经酰胺激活[15],这与本研究得到的主要富集在神经鞘之类信号通路相对应。神经酰胺作为皮肤屏障的有效成分，在AD的发病机制中已被广泛重视。已有研究阐明，CTSD参与谷氨酰转肽酶1的活性调节进一步影响表皮终末分化角质包膜形成[16]。鉴于此，推测CTSD与AD发病机制之间可能也存在关联。CORO1A是一种肌动蛋白结合蛋白，以钙依赖性方式调节细胞活性，参与多种细胞过程包括细胞周期进程、信号转导、凋亡、基因调控等。除先天性免疫方面的已知缺陷外，目前认为AD患者多形核中性粒细胞(PMN)功能损害也是造成皮肤感染的原因之一。PMN的转运主要依赖于β2整合素家族(CD11/CD18)[17],加之CORO1A已被证明作为β2整合素新型调控分子，诱导PMN黏附和黏附后事件起着至关重要的作用[18],因此，该基因的表达异常可能造成AD患者皮肤受感染。XPO1是一种细胞周期调控基因，通过调控细胞周期蛋白B、丝裂原活化蛋白激酶(MPAK)和MAPKAP激酶(MK)2的定位，可以参与细胞过程的调控，同时也能影响T细胞核因子(NFAT)和AP-1活性。在一项关于抗AD天然产物的全面回顾中，伪麻黄碱可以有效抑制NFAT、AP-1等活性对抗炎症反应[19],因此，XPO1可能作为其上游调控AD的进展。已有相关研究表明，通过XPO1释放核高迁移率旋蛋白(HMG)B1可能是在EP持续状态诱导的程序性坏死性神经元死亡的潜在治疗靶点[20],研究表明，XPO1抑制剂可显著抑制HMGB1从细胞核到细胞质的移位[21],而HMGB1作为AD经典炎症因子，也提示XPO1在特应性皮炎中具有一定作用。PASK是丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员，包含两个PAS结构域。该基因的表达受血糖调节，编码的蛋白在胰岛素基因表达中起作用。目前，AD与代谢综合征间存在显著相关性[22],且有研究表明，AD可能对糖尿病有保护作用[23],导致EP病因中代谢也是一方面。因此，提示PASK在两种疾病中均存在一定作用。

本研究通过交集从两种疾病数据库中得出的差异基因，寻找该两种疾病之间的共有基因再到核心基因，并进行生物过程分析和富集通路为理解AD提供了新视角。然而，本次分析的纳入样本量不足及对疾病的未细致分类，如年龄、疾病的临床分型等，需要扩大样本数据来支撑核心基因并针对不同临床分型进行针对性的研究，且在组织层面上缺乏相应的再次验证，以获得更可靠和具有特异性的靶点或作用轴。尽管如此，本研究在一定程度上再次加强AD并非为单纯的皮肤病而是系统性疾病的概念。总之，共有基因CTSD、CORO1A、XPO1、PASK的存在表明AD和EP之间存在关联性，提示两者疾病之间可能存在共同分子机制。

参考文献:

2中华医学会皮肤性病学分会免疫学组,特应性皮炎协作研究中心.中国特应性皮炎诊疗指南(2020版)[J].中华皮肤科杂志,2020;53(2):81-8.

3渠莉田,苏惠春,程波.特应性皮炎与系统性疾病相关性的研究进展[J].中华皮肤科杂志,2021;54(5):463-6.

4崔丽霞,刘军麟,刘琨,等.特应性皮炎精神心理合并症的研究进展[J].中国皮肤性病学杂志,2021;35(7):812-5.

12李萌萌,李薇.银屑病皮炎:一种新的疾病[J]?中国皮肤性病学杂志,2022;36(3):362-6.

基金资助:国家自然科学基金(81560503);

文章来源:徐香淑,李初颖,金哲虎.生物信息学分析预测特应性皮炎与癫痫的潜在关联性[J].中国老年学杂志,2024,44(17):4139-4143.