肝脏缺血再灌注损伤是指肝脏在缺血后恢复其血流供应时,肝细胞的代谢和功能障碍以及细胞形态和组织损伤较肝脏缺血时更为严重的一种现象,常见于肝叶切除术和肝脏移植等外科手术中[1]。一直以来,如何保护肝脏功能和减轻HIRI是临床上备受关注和亟待解决的问题。研究[2]发现高迁移率族蛋白1与缺血再灌注损伤这一类无菌性炎性反应、免疫反应密切相关,是目前研究的热点。在HIRI早期由于细胞应激或死亡的刺激,HMGB1从细胞核迁移到细胞质并进一步释放到细胞外,介导了一系列炎性反应、免疫反应的激活,是造成肝细胞损害和移植物免疫排斥反应的重要介质[3,4]。近期,有研究[5,6,7]发现电针预处理具有防治多种重要器官如脑、心脏缺血再灌注损伤的作用。实验[5,6]证实,电针预刺激“百会”具有减小小鼠脑缺血再灌注后脑梗死面积,减轻血脑屏障破坏和保护神经元的效果。电针预处理“内关”能够调节自噬,从而减轻心脏缺血再灌注损伤[7]。然而,将电针疗法用于防治HIRI的研究却鲜有报道。既往研究[8,9]中,针刺“肝俞”“阳陵泉”等穴位有保护肝脏功能、抑制炎性反应等作用。遵循中医“治未病”的理论,本研究通过构建70%HIRI模型来模拟肝脏手术过程中的HIRI现象,应用电针“肝俞”和“阳陵泉”对HIRI大鼠提前干预,观察其对肝脏功能和组织结构以及相关炎性因子和HMGB1表达的影响,并进一步分析探讨其机制。

1、材料与方法

1.1实验动物和分组

健康雄性SD大鼠40只,体质量(200g±20)g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,使用许可证号:SYXK(湘)2015-0013。饲养于湖南师范大学附属第一医院动物房(清洁级)内,室内温度20℃,湿度50%左右,自然照明。大鼠自由进食饮水,适应性饲养1周后,按照随机数字表法分为假手术组、模型组、肝俞-阳陵泉组和非经非穴组,每组10只。实验过程严格遵照科技部(2006)398号《关于善待实验动物的指导性意见》[10]文件要求执行。

1.2主要仪器及试剂

SDZ-Ⅱ型华佗牌电子针疗仪、华佗牌0.30mm×13mm不锈钢针灸针(苏州医疗用品厂有限公司),AnymicroDSSTM图像采集系统(湖南省人民医院病理科),LEICARM2245型石蜡切片机(德国徕卡公司),AU5800型全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司),RocheLightCycler480型实时荧光定量PCR仪(美国罗氏公司),H1650R型高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司),CX33型光学显微镜(日本奥林巴斯公司),电泳仪(美国Bio-Rad),湿转电泳槽(北京凯元信瑞仪器有限公司),ImageJ图像分析系统(美国NIH)。

HMGB1一抗(长沙维尔生物科技有限公司),山羊抗兔二抗(北京天德悦生物科技有限公司),肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、HMGB1ELISA检测试剂盒(北京环宇金科生物医学技术有限公司),总RNA抽提试剂盒(天根生化科技有限公司),反转录试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司),荧光定量PCR试剂盒(北京天根生化科技有限公司),10%水合氯醛溶液(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

1.3模型制备

在电针干预结束后,模型组、肝俞-阳陵泉组和非经非穴组大鼠参照Zabala等[4]方法造模。大鼠自由饮水,禁食6h,以10%水合氯醛溶液35mg/100g腹腔注射麻醉后,固定、备皮、消毒,于剑突下沿正中线做一约3cm切口,暴露肝门后解剖大鼠肝十二指肠韧带,分离供应肝中叶和肝左叶的动脉、静脉和胆管,使用无创动脉夹阻断1h,观察到大鼠肝中叶和肝左叶表面由于供应血流的阻断所致的苍白改变,即诱发了70%肝脏热缺血(hepaticwarmischemia,HWI)。松开血管夹后,腹腔内滴入0.9%的氯化钠溶液0.5mL,缝合腹部切口,4h后肝脏再灌注完成,观察到大鼠肝中叶和肝左叶表面由于缺血再灌注损伤后导致的花斑样和苍白条索样纹路改变,而肝右叶和尾状叶颜色外观呈正常粉红色,即为模型构建成功。假手术组大鼠仅行麻醉固定后剖腹、肝门暴露1h后缝合。

1.4干预方法

肝俞-阳陵泉组在造模前按照《实验针灸学》[11]选取大鼠双侧“肝俞”和“阳陵泉”,消毒后将规格为0.30mm×13mm的不锈钢针灸针刺入相应穴位,针刺深度均为5mm。同侧两根针柄分别连接电子针疗仪正负极,接通电源后将波形调至疏密波,频率为2Hz/100Hz,强度以能见到针体颤动为宜,干预时间为30min。

非经非穴组针刺两侧“肝俞”穴区外侧旁开6～8mm的非经非穴区肌肉结缔组织后,连接电子针疗仪。非经非穴组的电针干预参数与肝俞-阳陵泉组相同。

模型组、假手术组给予同样固定,不进行其他任何操作。

1.5观察指标及检测方法

肝脏形态学观察:各组实验结束后立即获取肝左叶组织块,以4%中性甲醛溶液固定48h,随后梯度乙醇脱水,浸蜡包埋、切片、贴片,62℃烤箱过夜,二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,3μm厚的组织切片用于HE染色,4μm厚的组织切片用于免疫组织化学染色。切片置于光学显微镜下观察各组大鼠肝脏组织的病理变化,并进行肝脏组织病理损伤评分。评分标准[12]为:0分为静脉血管及肝小叶内无炎性细胞浸润及肝细胞变性、坏死;1分为汇管区少量炎细胞浸润,肝细胞少量变性及坏死;2分为肝小叶内散在肝细胞变性及灶状坏死,肝组织内较多炎性细胞浸润,肝小叶结构尚完整;3分为肝窦、肝中央静脉内游血,广泛肝细胞变性、坏死,肝组织大量炎性细胞浸润,部分肝小叶破坏。

用全自动生化分析仪检测血清中谷丙转氨酶(alaninetransaminase,ALT)和谷草转氨酶(aspartateaminotransferase,AST)水平:再灌注4h后,从腹主动脉取血3～4mL于采血管中,直立静置30min后4℃、3000r/min离心20min,取其上清-20℃保存。所获取的标本均于24h内利用全自动生化分析仪检测血清中ALT和AST水平。

ELISA测定血清HMGB1、TNF-α和IL-6水平:取各组大鼠腹主动脉血3～4mL,直立静置30min后4℃、3000r/min离心20min,取上清-20℃保存备用,根据试剂盒标准完成操作流程后,通过绘制标准曲线计算蛋白水平。

免疫组织化学法检测HMGB1阳性表达:各组实验结束后立即取大鼠肝左叶组织并浸入4%多聚甲醛中,4℃固定24～48h。检测前制备石蜡切片,厚度4μm。将制备好的组织石蜡切片进行脱蜡、脱水、胰酶热修复、山羊血清室温封闭30min后,按一定比例稀释HMGB1抗体(1∶100),4℃孵育过夜;次日滴加二抗(1∶100)进行室温孵育,随后磷酸盐缓冲液洗涤;行二氨基联苯胺显色并在显微镜下控制反应时间,最后苏木素复染,脱水,树胶封片后,将制好的组织切片置于光学显微镜下观察,并使用ImageJ软件对染色照片进行分析,细胞内出现的棕黄色颗粒样沉淀即为HMGB1染色阳性。计算每个视野内HMGB1阳性细胞数量。

Westernblot法检测肝组织HMGB1蛋白表达:各组实验结束时立即取大鼠肝左叶组织块并冻存于液氮中。①使用预冷RIPA蛋白抽提试剂进行组织蛋白抽提,匀浆完成后在冰上孵育20min,4℃、13000r/min(离心半径8cm)离心20min后,取上清,待测。②BCA法进行蛋白定量,以RIPA调整蛋白浓度,煮沸变性5min。③配制12%分离胶和5%浓缩胶,按步骤上样后,通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间,然后进行转膜和封闭。④一抗HMGB1(1∶1000)稀释后4℃孵育过夜,TBST洗膜3min×5次。⑤HRP标记的二抗(1∶10000)稀释后,室温轻摇孵育40min,TBST洗膜6次,每次3min。⑥最后对目标蛋白进行曝光,以ImageJ软件分析各组条带,以β-actin为内参,计算蛋白的相对表达量。

荧光定量PCR检测肝组织中HMGB1mRNA表达:采用Trizol提取肝脏组织中总RNA,其浓度以及纯度测定使用紫外分光光度法检测。然后在荧光定量PCR仪上进行反应:①以总RNA为模板,将RNA逆转录为cDNA。②将1μLcDNA稀释后进行目的片段的扩增,20μL反应体系的反应条件如下:95℃预变性15min;95℃变性10s,60℃退火10s,72℃延伸30s,循环共计40次,相关引物序列见表1。③待反应完毕之后,以β-actin为内参,用2-△△Ct法计算HMGB1mRNA的相对表达量。

表1PCR引物序列

1.6统计学方法

使用GraphPadPrism8.0.1软件进行统计分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,组间比较用单因素方差分析,进一步两两比较使用Tukey检验。以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。

2、结果

2.1各组大鼠肝脏组织病理改变和病理损伤评分的比较

假手术组肝小叶结构完整清晰,汇管区内未见明显炎性细胞浸润,肝窦及肝细胞索结构正常,未见有明显的肝细胞变性及坏死;模型组见肝组织大范围出血坏死,汇管区大量炎性细胞浸润中央静脉,肝窦内亦有大量炎性细胞浸润,大量肝细胞索结构破坏,肝小叶结构尚正常;肝俞-阳陵泉组可见部分肝细胞水肿变性、坏死,散在空泡样变性,肝窦及汇管区可见少量炎性细胞浸润,部分肝细胞索结构破坏;非经非穴组的组织损伤表现类似于模型组。见图1。

病理损伤评分结果示,与假手术组比较,模型组大鼠肝脏损伤评分显著升高(P<0.01);与模型组比较,肝俞-阳陵泉组肝脏损伤评分降低(P<0.05),非经非穴组差异无统计学意义(P>0.05);非经非穴组肝脏损伤评分高于肝俞-阳陵泉组(P<0.05)。见图1。

图1各组大鼠肝脏组织病理改变(HE染色)及肝脏损伤评分比较

2.2各组大鼠血清ALT和AST含量的比较

与假手术组比较,模型组大鼠血清ALT和AST含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,肝俞-阳陵泉组大鼠血清ALT和AST含量显著降低(P<0.05),非经非穴组差异无统计学意义(P>0.05);非经非穴组大鼠血清ALT和AST含量高于肝俞-阳陵泉组(P<0.05)。见图2。

2.3各组大鼠血清TNF-α、IL-6和HMGB1含量的比较

与假手术组比较,模型组大鼠血清TNF-α、IL-6和HMGB1含量均显著增高(P<0.01);与模型组比较,肝俞-阳陵泉组大鼠血清TNF-α、IL-6和HMGB1含量降低(P<0.05),非经非穴组差异无统计学意义(P>0.05);非经非穴组大鼠血清TNF-α、IL-6和HMGB1含量高于肝俞-阳陵泉组(P<0.05)。见图2。

2.4各组大鼠肝脏组织HMGB1阳性表达的比较

假手术组大鼠肝脏组织仅可见少量HMGB1染色的棕褐色颗粒分布于胞核和胞质中;模型组可见大量肝细胞呈棕褐色深染的HMGB1强阳性表达;肝俞-阳陵泉组只有散在、部分肝细胞呈深棕褐色的HMGB1强阳性表达,可见大部分浅或较深褐色的HMGB1阳性细胞;此外,非经非穴组中可见较多呈深棕褐色的HMGB1强阳性肝细胞。与假手术组比较,模型组HMGB1阳性细胞数显著增多(P<0.01);与模型组比较,肝俞-阳陵泉组HMGB1阳性细胞数量降低(P<0.05),而非经非穴组差异无统计学意义(P>0.05);非经非穴组HMGB1阳性细胞数量高于肝俞-阳陵泉组(P<0.05)。见图3。

图2各组大鼠血清ALT、AST、TNF-α、IL-6和HMGB1含量的比较

图3各组大鼠肝脏组织HMGB1阳性表达的比较

2.5各组大鼠肝脏组织中HMGB1蛋白表达的比较

模型组肝脏组织HMGB1表达高于假手术组(P<0.01);与模型组比较,肝俞-阳陵泉组肝组织中HMGB1的表达量降低(P<0.05),非经非穴组差异无统计学意义(P>0.05);非经非穴组HMGB1蛋白表达高于肝俞-阳陵泉组(P<0.05)。见图4。

图4各组大鼠肝脏HMGB1蛋白表达水平比较

2.6各组大鼠肝脏组织中HMGB1mRNA表达的比较

与假手术组比较,模型组肝脏组织内HMGB1mRNA表达水平升高(P<0.01);与模型组比较,肝俞-阳陵泉组HMGB1mRNA的表达水平降低,(P<0.05),非经非穴组差异无统计学意义(P>0.05);非经非穴组HMGB1mRNA表达高于肝俞-阳陵泉组(P<0.05)。见图5。

图5各组大鼠肝脏HMGB1mRNA表达水平比较

3、讨论

本研究结果表明,在构建70%HIRI模型后,大鼠肝脏组织结构和细胞受到了破坏和损伤,血清中ALT、AST、TNF-α、IL-6和HMGB1水平均出现了明显的升高,而经“肝俞”“阳陵泉”穴预处理的大鼠,肝脏组织损伤相对轻,血清转氨酶、HMGB1和相关炎性因子水平亦低于模型组大鼠,提示电针预处理可能起到减轻HIRI的作用。在各组大鼠中,转氨酶、TNF-α和IL-6均表现出了较为一致的变化趋势,可能与HMGB1介导HIRI早期相关炎性反应的发生和发展有关[2,3,13]。在肝脏细胞应激、损伤或者死亡时,除了导致ALT和AST由于肝细胞受损而入血,还释放形成了包括HMGB1、热休克蛋白、细胞基质成分等产物,这些产物被称为损伤相关分子模式[13]。其中,HMGB1能够与Toll样受体(TLRs)尤其是TLR4配体和晚期糖基化终末产物受体相结合从而引起下游相关产物的表达,引起炎性因子如TNF-α和IL-6水平的升高[14]。Wang等[15]的研究证明了预给药齐墩果酸能够通过抑制HMGB1释放来减轻小鼠HIRI,使ALT、AST和TNF-α水平降低。Lundback等[16]报道了给小鼠注射HMGB1抗体能够减轻小鼠的药物性肝损伤,降低转氨酶和包括TNF-α等炎性因子的表达。此外,亦有研究[17]17]表明,他克莫司能够通过抑制肝脏细胞HMGB1的释放来减轻肝移植大鼠HIRI,降低IL-6和TNF-α水平。实际上,通过抑制HMGB1释放来发挥抗HIRI的研究并不少见,其中最常见的有HMGB1抗体和发现的丙酮酸乙酯(EP)等[16,18]。EP是最早发现的HMGB1释放抑制剂之一,相关研究[18,19]显示,EP可以明显降低血清和受脂多糖刺激的巨噬细胞培养液中HMGB1水平以及抑制巨噬细胞释放HMGB1。本研究中,电针预处理后HIRI大鼠肝脏细胞内移位和释放入血的HMGB1减少,继而抑制和避免了炎性反应的进一步扩大,降低了相关炎性因子的表达和水平,这可能是电针刺激能够发挥抗HIRI作用的机制。

既往研究[5,6,7]中,针刺预处理能够改善心、脑等器官的缺血再灌注损伤。在本研究中,通过免疫组织化学技术观察HMGB1蛋白在肝脏组织细胞中的表达和分布,结果显示电针预处理能够抑制HMGB1在肝细胞质内的分布;ELISA结果显示电针“肝俞”-“阳陵泉”能够降低HIRI大鼠外周血清HMGB1水平;Westernblot和PCR结果显示,电针可抑制HMGB1的表达,证明了电针预处理可能通过抑制HMGB1在肝细胞内产生、移位和释放,发挥保护肝脏功能,减轻HIRI的作用。

HIRI本质上属于无菌性炎性反应[2]。相关研究[15]表明,作为一种与DNA结合的核蛋白,HMGB1在HIRI早期即可被迅速动员到细胞内的其他位置,包括细胞质和线粒体,以及进入细胞外环境,参与识别和结合DNA、维持核小体的结构、调控DNA的复制转录等[4]。此外,依赖HMGB1/TLR4配体介导激活的HIRI固有免疫反应中产生的活性氧可通过Ca2+-K+泵反过来诱导HMGB1的释放,有研究[20]20]认为该环路可能是导致HIRI持续进展的原因之一。TLR4介导的干扰素控制因子1上调亦被认为是肝细胞释放HMGB1所需的必要条件[21]。

总之,本研究在HIRI大鼠上观察到,电针“肝俞”-“阳陵泉”能够改善肝脏缺血再灌注后的肝脏损害,其作用机制可能是通过抑制HMGB1移位和释放入血,从而抑制相关炎性因子的表达来实现的。

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