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龙花胶囊对提高化疗致血小板减少症小鼠血小板的实验研究

2023-07-27 50 上传者：管理员

摘要：探讨龙花胶囊治疗化疗导致的血小板减少症可能的作用机理。方法将造模成功的小鼠随机抽取50只，分为模型组、维血宁组、龙花胶囊小剂量组、中剂量组和大剂量组，空白组、模型组每日用0.9%Nacl灌胃，维血宁组用维血宁药液灌胃，龙花胶囊小剂量组、中剂量组、大剂量组分别用不同浓度的龙花胶囊药液灌胃，连续用药14 d;实验前和造模结束后的第7 d、14 d,取血检测小鼠外周血血小板数及血小板平均体积；造模结束后第14 d,取血测定血清IL-1、M-CSF含量；处死小鼠，剥离股骨，冲洗出全部骨髓，进行骨髓巨核细胞计数，并分离出脾脏及胸腺，计算脏器指数。结果与空白组相比，模型组血小板计数、体积、血清M-CSF、IL-1的含量上以及在提升小鼠脏器指数显著降低(P<0.01);与模型组相比，龙花胶囊不同剂量组血小板计数显著增加(P<0.01),体积、血清M-CSF和IL-1的含量，以及小鼠脏器指数显著增加(P<0.05)。结论龙花胶囊不仅能使化疗小鼠的一般情况得到改善，一定浓度(中、高浓度)的龙花胶囊可使血小板计数得到提升，血小板功能增强，骨髓巨核细胞增多，并且提高了血清IL-1、M-CSF的含量，恢复机体造血功能，除此之外还可以提高小鼠脾脏及胸腺指数，提高机体免疫力。

关键词：
IL-1
M-CSF
小鼠
血小板减少症
龙花胶囊
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据调查，目前国内肿瘤患者逐年增长，70%～80%是晚期肿瘤患者。而化疗是恶性肿瘤综合治疗的重要手段之一，通常80%～90%的化疗患者会出现白细胞降低，20%～30%的患者会出现明显的血小板减少的情况[1]。目前西医对于化疗诱发的血小板减少症(CIT)的治疗方法较多，常用的如输注血小板、重组人白介素-11(rhIL-11)、血小板生成素(TPO)等，但多因毒副作用大或价格昂贵而影响临床使用[2]。相比之下，中医学在整体观念和辨证论治理论指导下对防治化疗后血小板减少有较好的疗效。其主要治则有补气养血、扶正固本、滋补肝肾、健脾和胃，通过改善全身状况，恢复机体造血功能。龙花胶囊具体组成：花生衣、红枣、仙鹤草，是根据王希胜教授的经验方制成的中药复方制剂，通过多年临床实践在治疗化疗所致血小板减少症方面疗效明显。红枣，又称大枣，是我国民间周知的补气血要药；仙鹤草具有收敛止血的功效，主要用于治疗咯血、吐血、崩漏下血、血痢等，具有悠长的使用历史[3]。花生衣是花生的红色外皮，花生衣有补脾胃之气、补血生血的功效，可防治肿瘤患者化疗后的CIT,质优价廉，无不良反应[4]。而目前实验研究及临床报道表明[5,6],花生衣是确定可以升高血小板的中药[7,8,9]。本实验意在观察龙花胶囊对环磷酰胺(CTX)诱发血小板减少症小鼠诸多参与机体造血指标[白介素-1(IL-1)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)水平与血小板计数、血小板平均体积(MPV)、脏器指数及骨髓巨核细胞数量]之间可能存在的相关性[10,11],探讨龙花胶囊治疗化疗后血小板减少症的机制，为其在临床上的推广提供可靠的科学依据。

1、仪器与材料

1.1仪器

CKX31-A12PHP-OLIMPUS倒置显微镜(日本Olimpus);SW-CJ-1FD超净工作台(苏州净化设备厂);sysmexSF3000血球分析仪(日本希森美康);SZ61-SET解剖显微镜(日本Olimpus);MK3型酶标仪(美国Thermo);XS2-81光学显微镜(上海光学仪器厂)。

1.2试药

药物：龙花胶囊：[购置于陕西中医药大学附属医院制剂中心，将仙鹤草、大枣水提取液与花生衣乙醇提取液混合、浓缩、干燥、粉碎、制粒，装胶囊，0.35 g/粒(生药含量为0.1675 g/粒)];环磷酰胺注射液(批号：20100303,200 mg/支，山西普德药业有限公司);维血宁颗粒(生产批号：Z32020407,8 g/袋，江苏建民制药有限公司);0.9%氯化钠注射液(250 mL/瓶，四川科伦药业股份有限公司)。小鼠血清IL-1、M-CSF定量检测试剂盒(ELISA)均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3实验动物

昆明雄性小鼠100只(6～8周龄，体重18～23 g,清洁级),由第四军医大实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(陕2009-001)。实验环境：20～23℃,相对湿度40%～50%。

1.4药物剂量

本实验采用人与动物间按体表面积折算等效剂量的粗略折算法进行计算。龙花胶囊临床常用量为4粒/次，3次/日。将0.9%氯化钠注射液溶解的龙花胶囊按小、中、大剂量分别配成42 mg·mL-1,84 mg·mL-1,168 mg·mL-1的药液，分别给予0.84g·kg-1·d-1,1.68 g·kg-1·d-1,3.36 g·kg-1·d-1灌胃。维血宁药液180 mg·mL-1,给药时按体重计算为3.6 g·kg-1。

2、实验方法

2.1动物造模及分组

随机抽取10只小鼠，为空白组，第1天腹腔注射生理盐水0.4 mL/20 g,第2、3、6、7 d给腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.06 mL/20 g。其余小鼠进行造模。造模方法：环磷酰胺首次剂量给予200 mg·kg-1,按0.4 mL/20 g体重计算，可用0.9%氯化钠注射液配制成10 mg·mL-1的环磷酰胺药液给药；维持剂量30 mg·kg-1,按0.06 mL/20 g体重计算[12]。给予首剂量一次，第2、3、6、7 d给予维持剂量，1次/d,共4次，第10 d进行取血检查，将血小板下降至注射环磷酰胺前计数的20%～30%的小鼠纳入模型组，为造模成功[13,14,15,16]。造模成功率约89%。分组方法：从模型小鼠中随机抽取50只，分为模型组、维血宁组、龙花胶囊小剂量组、中剂量组和大剂量组，每组各10只。

2.2给药方法

空白组每日用0.9%氯化钠注射液灌胃，维血宁组用180 mg·mL-1维血宁药液0.4 mL灌胃，每日一次，龙花胶囊小剂量组、中剂量组、大剂量组，分别以42 mg·mL-1、84 mg·mL-1、168 mg·mL-1浓度的龙花胶囊药液0.4 mL灌胃，各组每日用药一次，连续用药14 d。

2.3检测项目、指标及方法

2.3.1一般项目

造模完成后，每天观察小鼠饮食、精神、活动、皮色和死亡等现象。

2.3.2检测PLT及MPV

实验前和造模结束后第7 d、14 d,于小鼠尾静脉各取血20μL,加入EDTA-NA固体抗凝剂的试管，用血球分析仪检测小鼠血液中PLT及MPV数值。

2.3.3血清IL-1、M-CSF含量的测定

造模结束后第14 d,摘取眼球取血，约1 mL滴入离心管中。静置1 h左右，置4℃冰箱过夜，次日取出样品离心10 min,吸出血清，分装于0.05～0.2 mL离心管，贮于-20℃冰箱冻存待测。血清IL-1、M-CSF含量用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法测定。

2.3.4骨髓巨核细胞计数

造模结束后第14 d处死小鼠分离股骨。用2.5 mL注射器吸取少量的PBS缓冲液，向骨髓腔内快速推入冲洗出骨髓细胞，定量涂片、风干，瑞氏姬姆沙染色、油镜下计数1.0 mm×1.0 mm范围内骨髓巨核细胞数，每只小鼠骨髓片制作3张，记录平均值。

2.3.5胸腺及脾脏指数

处死小鼠前用电子天平称重，取出胸腺及脾脏，用天平称出其重量，计算胸腺和脾脏指数。

2.4统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，所得到数值以均数±标准差表示，各组之间比较用单因素方差分析，以P<0.05作为显著性差异的标准。

3、结果

空白组小鼠无死亡，模型组死亡2只，维血宁组死亡1只，龙花胶囊小剂量组无死亡，中剂量组死亡1只，大剂量组死亡2只。龙花胶囊各组、维血宁组在提升血小板计数、骨髓巨核细胞数方面均有一定的作用，不仅能够提高血液中IL-1及M-CSF含量，而且增加血小板平均体积和免疫脏器指数。龙花胶囊大剂量组在提升血小板数量方面起效时间比维血宁组短；龙花胶囊中剂量组、龙花胶囊大剂量组较维血宁组、龙花胶囊小剂量组增加血小板平均体积方面有明显优势。在提高IL-1、M-CSF含量及增加骨髓巨核细胞数方面，龙花胶囊大剂量组与维血宁组相当。龙花胶囊小剂量组、龙花胶囊中剂量组无论是从改善小鼠一般情况、升高血小板计数及骨髓巨核细胞数、IL-1[17]及M-CSF含量，还是在增加血小板平均体积[18,19]及脏器指标方面，均没有龙花胶囊大剂量组效果稳定，考虑可能与剂量不足有关。

3.1一般情况

见表1。

3.2各组小鼠外周血血小板计数的比较

见表2。

3.3各组小鼠血小板平均体积的比较

见表3

3.4各组小鼠血清M-CSF、IL-1含量及骨髓巨核细胞计数的比较

见表4。

3.5各组小鼠脾脏、胸腺指数的比较

见表5。

3.6各组小鼠骨髓片

见图1。

4、讨论

龙花胶囊、维血宁在提升血小板计数、骨髓巨核细胞数方面均有一定的作用，不仅能够提高血液中IL-1及M-CSF含量，而且增加血小板平均体积和免疫脏器指数，但是本研究发现二者在改善机体的一般情况、提高造血和免疫功能方面仍存在着一定的差异。龙花胶囊大剂量组在提升血小板数量方面起效时间比维血宁组短，意味着见效快；龙花胶囊中剂量组、龙花胶囊大剂量组较维血宁组、龙花胶囊小剂量组增加血小板平均体积方面有明显优势，说明达到一定浓度后龙花胶囊药液不但使血小板数量得到恢复，而且血小板活性也在一定程度上得到增强，提高了血小板聚集和粘附能力防止机体发生出血倾向，骨髓造血功能得到恢复。在提高血清IL-1、M-CSF含量及增加骨髓巨核细胞数方面，龙花胶囊大剂量组与维血宁组相当，进一步证实了龙花胶囊通过刺激某些造血前体细胞及造血因子的增值，从而刺激机体加速生成血小板的目的，使化疗导致的骨髓抑制得到恢复，逐步改善造血环境。本实验发现，龙花胶囊小剂量组、龙花胶囊中剂量组无论是从改善小鼠一般情况、升高血小板计数及骨髓巨核细胞数、提高血清IL-1[17]及M-CSF含量，还是在增加血小板平均体积[18,19]及脏器指标方面，均没有龙花胶囊大剂量组效果稳定，考虑可能与剂量不足有关。另外有研究表明，龙花胶囊可以提高患者血中促血小板生成素水平以及血小板计数水平[20],且疗效不输于如注射重组人血小板生成素等药物治疗[21],从另一个侧面也验证本实验研究的结果。

肿瘤化疗所致血小板减少症(CIT)是指肿瘤化疗药物对骨髓产生抑制作用，导致外周血血小板计数低于正常值，是化疗过程中的常见不良反应，可导致化疗时间的延迟或限制剂量的使用，增加患者的出血风险，危及患者生命[22,23]。龙花胶囊不但能改善化疗诱导血小板减少症小鼠的一般情况提高血小板含量；而且增强了血小板聚集和粘附能力[24];提高了血清IL-1及M-CSF含量，且二者存在正相关性。龙花胶囊可以促进造血细胞增值、分化和存活[25],从而参与造血功能的恢复。龙花胶囊可以使化疗引起的血小板减少症小鼠的胸腺、脾脏指数升高，从一个方面提示其具有免疫调节作用，这可能与刺激髓某些外造血功能有关。根据本实验结果及既往相关实验研究[26],龙花胶囊不但可以治疗化疗引起的血小板减少症，而且为其应用到其他血小板减少性疾病中提供了实验支持。

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