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大肠杆菌O139诱导小鼠细菌性腹泻模型的构建

2023-08-19 171 上传者：管理员

摘要：仔猪水肿病是断奶仔猪一种常发性细菌性疾病，近年来发病率逐年增高，发病率在10%～20%，死亡率极高，严重影响了经济效益。产志贺毒素大肠杆菌（STEC）是引起猪水肿主要病原菌，其中以O抗原群O139最为常见，由于血清型众多、致病因子复杂多变，导致缺乏有效治疗药物，疫苗研发也进展缓慢。本实验以大肠杆菌O139诱导小鼠细菌性腹泻模型的构建，探索大肠杆菌O139在感染小鼠体内的动态分布，和各器官组织的病理学变化，为研究该菌的感染机制、建立病理学、病原学等诊断方法奠定了基础。

关键词：
大肠杆菌
实验动物
水肿病
细菌性腹泻
菌种
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仔猪水肿病是断奶仔猪一种常发性细菌性疾病，近年来发病率逐年增高，发病率在10%～20%，死亡率极高，严重影响了经济效益。产志贺毒素大肠杆菌（STEC）是引起猪水肿主要病原菌，其中以O抗原群O139最为常见，由于血清型众多、致病因子复杂多变，导致缺乏有效治疗药物，疫苗研发也进展缓慢。本实验以大肠杆菌O139诱导小鼠细菌性腹泻模型的构建，探索大肠杆菌O139在感染小鼠体内的动态分布，和各器官组织的病理学变化，为研究该菌的感染机制、建立病理学、病原学等诊断方法奠定了基础。

1、材料与方法

1.1实验动物和菌种

实验动物选用18～22克，6～8周龄C57BL/6小鼠280只，雌雄各半。小鼠自由采食和饮水，饲养于兰州大学实验动物中心SPF屏障环境内，饲喂SPF鼠料购于北京科澳协力饲料有限公司；饮水经杭州洁达净化科技有限公司生产的实验动物饮用水处理器处理；所用垫料高压灭菌，每周更换2次，换完垫料后用84消毒液等对饲养室进行消毒，每周紫外线照射1次。

大肠杆菌(E.coli:O139)由甘肃农业大学动物医学院微生物实验室提供。

1.2菌种活化及浓度测定

实验前将保存的E.coli:O139接种于普通琼脂斜面培养基上活化，然后接种于无菌新鲜肉汤2毫升中，37℃24小时后，取菌液2毫升扩培于无菌普通营养肉汤20毫升中，37℃18小时后，经活菌计数和比浊法测定，使用时稀释成不同浓度，计数后距感染时间不宜超过2小时。

1.3感染途径和剂量确定

经预实验确定感染途径和感染剂量。禁食不禁水12小时后，小鼠随机分5组，每组12只，雌雄各半，分笼饲养。第1组小鼠腹腔注射0.2毫升约1.5×108CFU；第2组灌胃接种0.2毫升菌液约1.5×108CFU；第3组鼻腔滴注浓缩菌液1～2滴约1.5×108CFU；第4组尾静脉注射0.2毫升菌液约1.5×108CFU；第5组设对照，腹腔注射0.2毫升生理盐水。定期观察小鼠精神状况、食欲、行为、粪便等临床症状，剖解自然死亡和脱颈致死的小鼠从组织脏器中分离该菌。

在确定感染途径后，禁食不禁水12小时后，小鼠随机分组，每组12只，雌雄各半，分笼饲养。距笼底2～3厘米处放置6毫米×6毫米铝网，并在笼底层放置102中速定性滤纸，每小时换一次滤纸。按每10克体重0.2毫升给菌，采用相同容积不同浓度感染。

1.3.1最小致死量和半数致死量(LD50)的确定

按照1.1倍梯度稀释，设计剂量分组为1.79×108CFU/毫升、1.63×108CFU/毫升、1.48×108CFU/毫升、1.35×108CFU/毫升、1.23×108CFU/毫升、1.12×108CFU/毫升、1.02×108CFU/毫升、0.93×108CFU/毫升、0.85×108CFU/毫升，连续观察10小时。采用加权回归法计算半数致死量(LD50)和最小致死量。

1.3.2半数感染量和最小感染量确定

根据半数致死量(LD50)和最小致死量，以组距1.1倍设计剂量分组，选择实验小鼠生命安全的的最低菌液浓度即最小感染量为试验注射浓度。

1.4腹泻模型的复制

选择实验小鼠生命安全的的最低菌液浓度即最小感染量为试验注射浓度，选取20只小鼠复制腹泻模型，并设立健康对照组。连续观察5天，观察感染后小鼠临床症状、体重变化、血液生化指标、病理变化、脏器重量、脏器系数等。记录总便数、稀便数、腹泻指数（DI）和稀便级。分别称取模型组和对照组小鼠体重后，从眶后静脉窦采血分离血清，检测ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）、AST/ALT（谷草转氨酶/谷丙转氨酶）、TP（总蛋白）、ALB（白蛋白）、GLO（球蛋白）、A/G（白蛋白/球蛋白）、ALP（碱性磷酸酶）、GLU（葡萄糖）、BUN（尿素）、CREA（肌酐）、BUN/CR（尿素/肌酐）、CHO（胆固醇）、TG（甘油三酯）、I-BIL（间接胆红素）等15项指标。解剖观察病理变化，依次取出心、肝、脾、肺、肾，用滤纸吸去各脏器表面的血液后称取湿重，计算脏器系数。并涂片镜检，进行细菌培养分离和生化鉴定。统计分析，数据描述以x±s表示；品系间用单因素方差分析；两样本用t检验。

2、结果

2.1不同感染途径的比较

灌胃感染组和鼻腔滴注感染组在预试中最高剂量1.5×108CFU/毫升，仍未致病，大便培养也未见该菌生长；尾静脉接种在预试中临床表现不显著，大便培养不稳定。腹腔注射组在所设计的剂量范围内呈梯度发病和死亡，大便细菌培养均呈阳性。结果表明，腹腔注射诱导动物腹泻模型是比较可行的方法，感染小鼠的各个脏器发生了病理变化。

2.1.1腹腔感染途径

在接种2小时后，小鼠都出现扎堆，被毛粗乱，精神萎靡，行动迟缓，丧失正常的跳跃、爬笼行为。部分小鼠在接种3～4小时后表现出腹泻症状，持续4～5小时；6小时后眼角出现粘性分泌物，9小时后，呼吸减弱，不停抽搐；10小时后，睫毛反应消失，但仍不停抽搐。在接种后的4小时出现小鼠死亡，18～24小时达到死亡高峰期，72小时后不再出现小鼠死亡。

剖解可见：皮下呈弥漫性出血；脾脏明显肿大，胆囊充盈；肝脏肿大，质地变脆；肠道内充满黄色液体，部分小肠肠系膜肿大。有的小鼠胸腔积液，脑部有出血点。剖解自然死亡和脱颈致死的小鼠，可从小鼠的心、肝和脾中分离出该菌，并且这种情形可持续3天，5天后心、肝中很难再分离出该菌，脾脏中仍可分离出该菌。

2.1.2灌胃感染途径

接种后，28～32小时后小鼠出现精神萎靡，食欲减退，活动减少，扎堆，大部分小鼠尿液颜色加深。死亡多发生在40～72小时。剖解发现，死亡小鼠腹腔内有浆液性渗出，脾脏坏死，肝脏边缘坏死，肺脏无明显病变，肠道内充满黄色液体。剖解死亡小鼠，可从小鼠的肝脏和脾脏中分离出接种菌，但5天后肝脏和脾脏中很难分离出细菌，十二指肠中则可分离出该菌。

2.1.3鼻腔感染途径

接种后，小鼠出现一过性食欲降低，行动减少。数小时后，采食和行动恢复正常。未出现死亡，脱颈致死后，剖解可见个别小鼠脾脏肿大，其它器官组织未发生明显病变。各内脏器官中未分离到该菌。

2.1.4尾静脉感染途径

仅有1只小鼠死亡，剖解出现败血症状。同组其它小鼠各器官组织未发生明显病变。从死亡小鼠的组织脏器中分离到该菌，其他小鼠各组织器官未发现该菌。

2.1.5对照组

对照组小鼠无异常，正常采食、饮水，并有正常的跳跃和爬笼行为。

2.2感染剂量的确定

2.2.1最小致死量和半数致死量（LD50）的确定

使用加权回归法计算半数致死量（LD50）为0.93×108CFU/毫升。

2.2.2半数感染量和最小感染量确定

选择实验小鼠生命安全的最低菌液浓度即最小感染量为最佳试验注射浓度即0.58×108CFU/毫升，每10克体重0.2毫升腹腔注射。

2.3腹泻模型的复制

2.3.1临床症状

在接种30～60分钟后，所有小鼠均出现被毛粗乱，扎堆，精神沉郁，食欲减退，眼睛半眯，行动迟缓，丧失正常的清理、跳跃、爬笼行为。3～4小时后开始出现腹泻症状，持续4～5小时，四肢和尾根处有粪便粘连，食欲废绝；6小时后眼角出现分泌物，初为无色稀薄粘性分泌物，后逐渐转为白色粘稠分泌物，在18～24小时白色粘稠分泌物可糊住眼睛四周，小鼠眨眼反应或对外界应激反应迟缓甚至消失；9小时后，呼吸减弱，不停抽搐；10小时后，睫毛反应消失，但仍不停抽搐，有个别小鼠出现神经症状，四肢呈游走状，有的小鼠不停向一侧转圈。个别小鼠出现渐进性消瘦，被毛直立，毛色光泽降低。10～16小时排便量和尿量减少，甚至几乎无排泄物。小鼠牙关紧闭，身体重量明显减轻，眼角有大量粘稠分泌物，尾巴和四肢末梢发绀，肛门周围也沾有排泄物和垫料。

2.3.2剖解观察

剖解后，皮下呈弥漫性出血；肝脏肿大，质地变脆，肝脏表面有点状出血点；胆囊充盈；脾脏肿大；肠道内充满黄色液体，肠粘膜潮红、肿胀，粘膜表面有大量的炎性渗出物。渗出物因病程发展有所不同，初期渗出物多呈水样、鸡蛋清样的浆液状，后因黏膜上皮细胞中的杯状细胞分泌粘液增多从而导致渗出物粘稠，最终由于炎性细胞的侵润和黏膜上皮细胞剥落导致渗出物变为脓液样。肠壁淋巴小结呈堤坝样隆起，严重时肠道粘膜面呈糜烂样。

2.3.4脏器重量和脏器系数变化（见下表）

测定小鼠(心、肝、脾、肺、肾)脏器系数进行统计学分析，模型组与对照组小鼠脏器系数相比差异显著（P<0.05），同时模型组各脏器相比对照组有明显眼观变化。结果表明，各脏器呈现不同程度的细胞肿胀、水肿、充血、出血、增生、肥大、肿大等病理变化时，导致该脏器的重量增加，各脏器未见脱水、萎缩、萎陷、坏死和腐离等病理变化，食欲下降或消化功能减弱等引起体重增长减慢和伴随器官系数的相对增大。

2.3.5血清生理指标

血液生理指标常作为毒理学实验中的测评指标。本实验中ALT、AST、AST/ALT、TP、ALB、GLO、A/G、ALP都反映肝功能受损情况的指标。ALT和AST的升高反映肝细胞受损程度严重；TP下降，ALB、GLO、A/G减少表明肝脏炎症严重；ALP增加表明肝脏有炎症或肝内胆汁淤积导致ALP活力增加；BUN、CREA、BUN/CR是衡量肾功能的指标。BUN和CREA的数值增加代表肾功能发生障碍；GLU是血液中血糖浓度的一项指标，GLU降低；CHO和TG是衡量血液中血脂水平的指标，CHO和TG升高，同对照组相比，上述相应指标差异显著（P<0.05），表明对小鼠血液生理指标产生影响。

2.3.6病理组织学变化

小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠组织在显微镜下均见异常。小鼠心肌纤维横纹可见，间质无水肿和炎性细胞浸润，但呈现出血现象；肝脏肝小叶结构不完整，肝细胞广泛变性、水肿，肝脏充血、出血，表层部分肝细胞变性、坏死，可见广泛性坏死灶(见图A)；脾脏充血、出血，白髓受到红细胞挤压，发育不良，淋巴小结萎缩，白髓、红髓及边缘区结构不太清晰(见图B)；肾脏表层肾小管上皮细胞变性坏死，肾脏充血、出血，肾小囊腔内有渗出物，肾曲小管上皮肿胀(图C)；小肠粘膜组织学形态异常，固有层见炎性反应，肠粘膜肿胀，导致胆管开口处变得狭窄或闭锁，胆汁排入肠管的量减少或缺乏，导致肠内细菌繁殖较快，引起病变，十二指肠肠绒毛脱落，溶解，肠道固有层有大量淋巴细胞侵润(见图D)；空肠的微绒毛脱落，局部肠绒毛断裂，肠管充血，出血(见图E)；回肠肠绒毛严重脱落，固有层严重充血(见图F)；回肠HE×400：固有层严重充血，淋巴小结肿大(见图G)；盲肠肠绒毛脱落严重，淋巴小结增大，固有层淋巴细胞增生(见图H)；结肠肠绒毛几乎全部脱落(见图I)。

3、讨论

3.1不同感染途径的比较

鼻腔接种后，小鼠未出现临床症状，组织脏器也未分离该菌，而且血清学检测也未发现抗体，说明小鼠对鼻腔接种不易感。这与文献报道的肠道菌不易通过呼吸道感染相一致。灌胃接种，要求接种剂量一定准确，存在伤及食管和误入气管的可能性，而且接种前未对胃酸进行预处理，这导致部分小鼠造模效果不理想。尾静脉注射后，接种剂量偏小，细菌会被白细胞吞噬，小鼠不表现临床症状；但如果接种剂量偏大，又会迅速造成小鼠死亡。腹腔注射，选择剂量范围相对广泛而且易于操作。腹腔注射组在设计的剂量范围内呈梯度发病和死亡，死亡时间都在注射后4～72小时内，表现出急性死亡、神经症状和败血症状，与自然发病仔猪、犊牛、鸡等临床症状和病理变化相同。本研究观察发现小鼠发生最后死亡的时间为接种后3天。未死亡小鼠并不表现出明显的临床症状，但剖解可见脾脏肿大。在腹腔注射相同接种剂量，小鼠出现的神经症状存在一定差异。这与文献报道的肠道菌引起动物神经症状不稳定相一致，证实本研究采用的腹腔注射0.58×108CFU/毫升，可成功构建大肠杆菌O139诱导小鼠腹泻模型。

3.2腹泻模型的复制

猪水肿病是STEC产生的F18菌毛和Stx-2e毒素等引起，通过菌毛介导的黏附作用，定植于肠上皮细胞并产生毒素，主要血清型为O139，该病发病率较低，但死亡率可高达90%以上。在不同条件下O139定居于小肠上皮细胞有时既可引起断奶仔猪腹泻也可引起水肿病(PWECD/ED)，但目前对于该病的防控主要侧重养殖场的生物安全管理和预后治疗上，尚无理想的疫苗，尤其是2020年国家全面禁止，对于替抗药物的研发迫在眉睫。但目前国内外多数研究仅将菌毛和毒素抗原纳入，缺乏有效的动物模型也是疫苗和药物研发的一个阻力。

本实验选用C57BL/6鼠相比BALB/c小鼠不易发生呼吸道感染及肺炎。大肠杆菌O139诱导的肠粘膜充血和炎性刺激物的作用，使肠管的运动和分泌机能增强，引起腹泻，排出水样带腥臭的粪便，导致大量水分和消化液中的钾钠离子或重碳酸盐随粪便流失，从而使机体脱水和代谢性酸中毒，使得动物的食欲下降或消化功能减弱等引起动物的体重增长减慢和伴随器官系数的相对增大。大肠杆菌O139构建的腹泻模型空肠、回肠段肠绒毛严重脱落、溶解，本研究结果与上述文献报道一致。感染O139后，该菌的F18a、F18b菌毛和小肠上皮细胞相应的受体结合，黏附于小肠绒毛并大量繁殖，并产成大量Stx2e毒素被肠道吸收。Stx2e作为一种血管毒素，损伤血管内皮细胞，导致血管通透性发生变化，出现水肿，有时压迫脑部神经组织，临床出现神经症状。

本试验成功构建大肠杆菌O139诱导小鼠腹泻模型，研究结果为该病的诊断、预防和治疗奠定了科学的理论基础，并为相关药物和疫苗研发提供了动物模型。

文章来源:张莉,王佳,豆思远等.大肠杆菌O139诱导小鼠细菌性腹泻模型的构建[J].北方牧业,2023(16):14-16.