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耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌感染特征及改良显色平板筛查性能

2024-02-23 392 上传者：管理员

摘要：目的了解耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)感染特征，并对改良显色平板在其筛查中的性能进行评价。方法收集2021年至2022年本院临床分离出的48株CRE菌株，同时选取20株碳青霉烯类药物敏感肠杆菌科细菌用于特异度的研究。采用PCR方法检测48株CRE菌株与20株碳青霉烯类药物敏感肠杆菌科细菌KPC、IMP、OXA-48、NDM、TEM的携带情况。分别制备三种改良显色平板，对比分析不同平板在耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌筛查中的性能。结果 48株临床分离的CRE菌株中，主要为肺炎克雷伯菌(75.00%,36/48)。主要分离自痰液标本(56.25%,27/48),其他依次来源于血液标本、中段尿标本、肺泡灌洗液标本、胸腹腔积液标本、导管尖端标本、分泌物标本、脑脊液标本。29株分离自重症监护病房，8株分离自呼吸科，3株分离自神经外科，肾内科、普外科各2株，烧伤科、血液科、骨科、肿瘤科各1株。36株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌中，28株检出KPC型基因，4株检出NDM型基因，2株检出IMP型基因，2株检出KPC+NDM型基因。5株耐碳青霉烯类大肠埃希菌中，3株检出NDM型基因，2株分别检出KPC型基因、IMP型基因。2株耐碳青霉烯类奇异变形杆菌中，1株检出KPC型基因，1株检出NDM+TEM型基因。2株耐碳青霉烯类产酸克雷伯菌中，1株检出NDM型基因，1株检出NDM+TEM型基因。2株耐碳青霉烯类产气肠杆菌中，1株检出KPC型基因，1株检出NDM型基因。1株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌检出NDM型基因。20株碳青霉烯类药物敏感肠杆菌未检出耐药基因。44株在美罗培南改良显色平板上生长，敏感度为91.67%,特异度、阳性预测值均为100%。42株在亚胺培南改良显色平板上生长，敏感度为87.5%,特异度、阳性预测值均为100%,阴性预测值为76.92%。46株在厄他培南改良显色平板上生长，敏感度为95.83%,特异度为95%,阳性预测值为97.87%,阴性预测值为90.48%。结论临床分离的CRE菌株中，以肺炎克雷伯菌为主，主要分离自痰液标本、重症监护病房。

关键词：
性能评价
改良显色平板
耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌
耐药基因
耐药菌株
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肠杆菌科细菌作为人类正常定植的重要菌群之一，可引发多种感染性疾病，同时可通过不同方式获得耐药性，成为耐药菌株。耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenemresistant Enterobacteriaceae,CRE),作为一种对碳青霉烯类抗生素表现出高耐药率的多重耐药菌株，近些年来临床分离率逐年升高，已经对全球公共卫生安全形成重大威胁[1,2,3]。相关研究显示，CRE菌株主要以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌，通过产生碳青霉烯酶，使其对碳青霉烯类抗生素失效，是CRE的主要耐药机制，其中最常见的酶是KPC[4]。目前，CRE主动筛查的方法较多，但对操作人员要求较高，不适于临床广泛开展[5]。因此，建立一种快速、简便、价廉的筛选方法对控制CRE进一步传播与感染具有重要意义[6]。

1、材料与方法

1菌株来源

收集2021年1月1日至2022年12月31日，本院临床分离出的48株CRE菌株。所涉及标本类型包括痰液、血液、中段尿、肺泡灌洗液、胸腹腔积液等，菌株科室分布包括重症监护病房、呼吸科、神经外科、肾内科、普外科、烧伤科、血液科、骨科、肿瘤科等。耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌判定符合《中国碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌感染诊治与防控专家共识》相关标准[7]。同时选取20株碳青霉烯类药物敏感肠杆菌科细菌用于特异度的研究。

2病原菌鉴定及药敏试验

将冻存的菌株复苏后分区划线接种于不同培养基上，36℃恒温环境下培养24～48 h后，取单个菌落接种于琼脂平板或MH平板上，继续培养24～48 h。采用全自动微生物分析仪(MicroScan WalkAway 96,德国西门子)进行病原菌鉴定与药敏试验。

3碳青霉烯类耐药基因检测

采用PCR方法检测48株CRE菌株与20株碳青霉烯类药物敏感肠杆菌科细菌的KPC、IMP、OXA-48、NDM、TEM基因型携带情况。

3.1 DNA模板制备

在无菌试管中加入去离子水，然后加入饱满菌落振荡摇匀，经100℃水浴加热后，冰浴处理至50℃左右，离心处理后，取上清液，保存于-20℃中备用。

3.2引物序列合成

引物序列合成参照相关文献[8],由钱塘生物科技有限公司合成。

3.3 PCR反应体系及条件

反应体系：DNA模板2μL,12.5μL rTaq Premix 10μL,2.5μL dNTPs, 2.5μL 10×PCR buffer,上、下游引物分别取1μL,加入灭菌去离子水，共25μL。反应条件：95℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 55～57℃退火30 s, 72℃延伸45 s,共35次循环；72℃终延伸5 min,于4℃保存。

3.4琼脂糖凝胶电泳

制备琼脂糖凝胶，将冷却固定后的琼脂糖凝胶放入电泳槽内，加入PCR产物电泳35 min,结束后利用凝胶成像分析系统观察结果并拍照图像。

4改良显色平板在CRE筛查中的性能评价

4.1制备三种改良显色平板

称取科马嘉干粉(33 g)及麦康凯琼脂干粉(51.5 g),加入1 000 mL蒸馏水，待其完全溶解后，进行高压灭菌处理。冷却后，加入根据CLSI指南中肠杆菌科的药敏判断折点制定好浓度的三种碳青霉烯类抗生素，制成三种改良显色平板，晒干备用。

4.2敏感度与特异度检测

将本次研究中的49株CRE菌株与20株碳青霉烯类药物敏感肠杆菌复苏后，接种于血平板上，进行增菌培养。挑选饱满菌落配置菌悬液，分别取等量的菌悬液接种于三种平板上，培养16～18 h,观察并记录。以PCR检测结果为检测“金标准”,对比不同改良平板的筛查性能。

2、结果

1 48株CRE菌株分布情况

48株临床分离的CRE菌株中，36株为肺炎克雷伯菌(75.00%,36/48),5株为大肠埃希菌(10.42%,5/48),2株为奇异变形杆菌(4.17%,2/48),2株为产酸克雷伯菌(4.17%,2/48),2株为产气肠杆菌(4.17%,2/48),1株为阴沟肠杆菌(2.08%,1/48)。

2 48株CRE菌株标本来源及科室分布

48株CRE菌株中，27株分离自痰液标本(56.25%,27/48),7株分离自血液标本(14.58%,7/48),5株分离自中段尿标本(10.42%,5/48),3株分离自肺泡灌洗液标本(6.25%,3/48),2株分离自胸腹腔积液标本(4.17%,2/48),2株分离自导管尖端标本(4.17%,2/48),1株分离自分泌物标本(2.08%,1/48),1株分离自脑脊液标本(2.08%,1/48)。48株CRE菌株分离自不同科室，其中29株分离自重症监护病房(60.42%,29/48),8株分离自呼吸科(16.67%,8/48),3株分离自神经外科(6.25%,3/48),2株分离自肾内科(4.17%,2/48),2株分离自普外科(4.17%,2/48),1株分离自烧伤科(2.08%,1/48),1株分离自血液科(2.08%,1/48),1株分离自骨科(2.08%,1/48),1株分离自肿瘤科(2.08%,1/48)。

3 48株CRE菌株碳青霉烯酶耐药基因携带情况

48株CRE菌株中，44株检出一种耐药基因(91.67%,44/48),其中30株检出KPC型基因(62.5%,30/48),11株检出NDM型基因(22.92%,11/48),3株检出IMP型基因(6.25%,3/48)。4株检出两种耐药基因(8.33%,4/48),其中2株检出KPC+NDM型基因(4.17%,2/48),2株检出NDM+TEM型基因(4.17%,2/48)。20株碳青霉烯类药物敏感肠杆菌未检出耐药基因。见表1。

4三种改良显色平板筛查性价对比

4.1美罗培南改良显色平板筛查性能

44株在美罗培南改良显色平板上生长(44/48,91.67%),4株未生长，20株碳青霉烯类药物敏感肠杆菌均未生长。美罗培南改良显色平板的敏感度为91.67%(44/48),特异度为100%(20/20),阳性预测值为100%(44/44),阴性预测值为83.33%(20/24)。

表1 48株CRE菌株碳青霉烯酶耐药基因携带情况

4.2亚胺培南改良显色平板筛查性能

48株CRE菌株中，42株在亚胺培南改良显色平板上生长(42/48,87.5%),6株未生长，20株碳青霉烯类药物敏感肠杆菌均未生长。亚胺培南改良显色平板的敏感度为87.5%(42/48),特异度为100%(20/20),阳性预测值为100%(42/42),阴性预测值为76.92%(20/26)。

4.3厄他培南改良显色平板筛查性能

48株CRE菌株中，46株在厄他培南改良显色平板上生长(46/48,95.83%),2株未生长，19株碳青霉烯类药物敏感肠杆菌未生长。厄他培南改良显色平板的敏感度为95.83%(46/48),特异度为95%(19/20),阳性预测值为97.87%(46/47),阴性预测值为90.48%(19/21)。

3、讨论

近年来，CRE已经成为一种严重致病菌，对生命健康造成严重威胁[9]。本次研究中，48株临床分离的CRE菌株主要为肺炎克雷伯菌，与陈亚男等[10]研究结果一致。本次研究中，48株CRE菌株主要分离自痰液标本，其次为血液标本，主要分布于重症监护病房。重症监护病房患者大多为病情严重，机体免疫力显著降低，高效广谱抗菌药物的使用率高于其他病房患者，因此CRE的分离率高于其他病区[11]。

本次研究48株CRE菌株中，44株检出一种耐药基因，4株检出两种耐药基因。36株肺炎克雷伯菌，主要检出KPC型基因。5株大肠埃希菌中，主要检出NDM型基因。20株碳青霉烯类药物敏感肠杆菌均未检出耐药基因。碳青霉烯酶主要包括A类丝氨酸酶及B类金属酶，其中A类的KPC型为主要基因型，KPC酶通过水平传播和克隆传播两种形式，在不同菌种间进行快速传播，造成医院感染的暴发流行[13]。

本次研究中，厄他培南的敏感度、阴性预测值均高于美罗培南和亚胺培南，特异度、阳性预测值较低。与陈善建等[14]研究结果一致。Ramachandran等[15]通过药物结构、分子动力学角度分析三种碳青霉烯类药物抑菌效果的差异性，发现美罗培南、亚胺培南治疗效果更好，为本次研究结果提供了理论依据。

综上所述，临床分离的CRE菌株中以肺炎克雷伯菌为主，主要分离自痰液标本、重症监护病房。建立快速、准确的CRE筛查方法具有重要意义，厄他培南改良显色平板相对比其他两种改良显色平板具有更高的敏感度，更适用于临床微生物实验室的推广应用，对CRE的预防和控制具有重要临床意义。

参考文献:

[4]南超,黄一凤,马娜,等.ICU患者耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药及传播机制的分析[J].中国病原生物学杂志,2022,17(5):578-581.

[7]中国碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌感染诊治与防控专家共识编写组,中国医药教育协会感染疾病专业委员会,中华医学会细菌感染与耐药防控专业委员会.中国碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌感染诊治与防控专家共识[J].中华医学杂志,2021,101(36):2850.

[10]陈亚男,刘菁,李爱民,等.304例耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌医院感染流行病学特征与干预措施及效果[J].中华医院感染学杂志,2022,32(10):1450-1453.

[11]潘璐,朱凤雪,李纾,等.重症监护病房中耐碳青霉烯类肠杆菌感染危险因素分析[J].中国医药,2016,11(8):1200-1203.

[12]陆书华,李晓哲,刘凌云,等.山东某院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌临床感染特征及耐药基因分析[J].检验医学,2020,35(8):757-762.

[14]陈善建.改良CRE筛查显色平板的性能评价及其应用[D].福建医科大学,2019.

文章来源:郭宾,饶姣玥.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌感染特征及改良显色平板筛查性能评价[J].中国病原生物学杂志,2024,19(03):341-344.