首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 基础医学论文 > 实验医学论文 > 丹参酮抑制去卵巢肥胖大鼠体质量及其作用机制

丹参酮抑制去卵巢肥胖大鼠体质量及其作用机制

2024-05-11 17 上传者：管理员

摘要：目的研究丹参酮对去卵巢大鼠体质量影响及其分子机制。方法将32只健康雌性SD大鼠随机分为假手术组、去卵巢组、雌激素组和丹参酮组，每组8只，实验40 d。记录每组体质量和摄食量，检测大鼠血糖、血脂、肝肾功能等生化指标，检查血清雌激素、瘦素、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量，检测下丘脑刺鼠相关蛋白(AgRP)/可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)mRNA和蛋白表达。结果去卵巢组体质量(25 d开始)、每日摄食量、血清三酰甘油、瘦素、TNF-α含量和下丘脑AgRP mRNA和蛋白表达明显高于假手术组、雌激素组和丹参酮组(P<0.05);去卵巢组子宫重量、雌激素含量明显低于假手术组和雌激素组(P<0.05);去卵巢组CART mRNA和蛋白表达明显低于假手术组、雌激素组和丹参酮组(P<0.05)。结论丹参酮可以改善去卵巢后大鼠体质量和血脂代谢；丹参酮抑制去卵巢大鼠体质量可能是通过调控下丘脑摄食中枢AgRP/CART信号通路减少去卵巢大鼠摄食量实现的。

关键词：
丹参酮
刺鼠相关蛋白(AgRP)
去卵巢
可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)
肥胖
加入收藏

随着女性卵巢功能的停止，体内雌激素水平急剧下降，月经永久性停止，医学上称之为绝经[1]。女性绝经后会出现一系列激素相关的疾病。研究发现，绝经后出现的心血管疾病、糖尿病和恶性肿瘤等疾病都与绝经后肥胖有关[2,3]。因此，干预绝经后肥胖是改善其他慢性病的基础。绝经后肥胖与女性体内雌激素减少有关。女性体内雌激素减少后引起下丘脑摄食中枢调节异常，促进食欲亢进，增加摄食量[4]。下丘脑弓状核包含两类神经元，一是分泌抑制食欲的阿黑皮素原(POMC)和可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)神经元，二是分泌促进食欲的神经肽(NP)Y和刺鼠相关蛋白(AgRP)神经元[5,6]。雌激素可通过抑制促进食欲的基因和促进厌食基因的表达改善雌激素缺失后的食欲增加，减少进食量[7]。雌激素替代疗法常用来治疗绝经后肥胖，但其会引起绝经后女性乳腺癌、子宫内膜癌等疾病[8]。于是找到一种能替代雌激素改善绝经后症状但是又没有雌激素副作用的天然产物越来越受到关注。

丹参是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，功效为活血祛瘀、调经止痛、清心除烦和凉血消痈。前期实验表明丹参水煎剂能明显减低去卵巢肥胖大鼠的体质量，但其有效成分发挥作用尚不明确。丹参酮主要是丹参的脂溶性提取物，主要应用于心血管、肝脏、肾脏和肺脏等器官，发挥抗血栓、抗炎、抗氧化、降脂和抗肿瘤等功能[9,10,11,12]。研究表明[13],丹参酮可抑制卵巢大鼠体质量增加，但是丹参酮是否通过下丘脑摄食中枢信号通路抑制去卵巢大鼠体质量目前尚不清楚。本研究拟分析丹参酮是否通过调节下丘脑摄食中枢信号通路减少去卵巢大鼠摄食量来改善去卵巢导致的大鼠体质量增加。

1、材料与方法

1.1实验药物

丹参酮购于中国陕西森弗生物技术有限公司；雌激素和羧甲基纤维素钠购于美国Sigma公司。

1.2实验动物

32只SPF级SD雌性大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2012-0001]。大鼠体质量(220±10)g,大鼠饲养于南京医科大学公共卫生学院动物饲养中心[SYXK(苏)2016-0016],饲养环境为：温度(23±2)℃,湿度为：55%～65%,光照为：12 h(白天/黑暗)。每笼4只大鼠，每周换1次鼠笼和饮水瓶，大鼠的常规饮食由动物房提供。

1.3试剂

瘦素和肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)测定试剂盒购于美国R&D公司；RNA提取试剂Trizol、逆转录试剂盒、实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒，均购自TaKaRa公司；刺鼠相关蛋白(AgRP)和可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)、18S引物由中国深圳华大基金公司合成。抗体AgRP和CART购于美国CST公司；抗体磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),兔抗和鼠抗购于中国碧云天生物工程有限公司。

1.4仪器

Infinite M2000酶标仪(瑞士TECAN Group公司)、蛋白电泳系统(美国Bio-Rad公司)、蛋白半干转膜系统(上海天能科技有限公司)、Fresco21高速低温离心机、核酸蛋白分析仪、逆转录仪、-80℃超低温冰箱(美国Thermo Scientific公司)、LightCycler 96 qRT-PCR仪(瑞士Roche公司)、自动生化分析仪(7100型，日本日立公司)。

1.5动物分组及实验干预

按照体质量将大鼠随机分成4组，分别为假手术组、去卵巢组、雌激素组和丹参酮组，记录好每组初始体质量。大鼠在动物房适应1 w后，进行去卵巢手术。用麻醉剂戊巴比妥钠将大鼠麻醉后，除假手术组外，其他各组手术去除双侧卵巢，假手术组仅去除卵巢旁等量脂肪组织。大鼠手术恢复后给药。所有的药品都溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液，雌激素给药量为1 mg/kg,丹参酮给药量为60 mg/kg。所有大鼠每天同一时间段灌胃给药，给药周期40 d。每天称量每笼大鼠的摄食量和饮水量，每周称量大鼠的体质量，记录好相应的数据。在40 d实验周期结束后，比较每组最终体质量差异。根据大鼠40 d摄食总量计算大鼠平均每天摄食量，最后比较每组大鼠平均摄食量差异。分析体质量增长和摄食量之间的关系。

1.6动物样品收集

大鼠处死前禁食12 h。麻醉后腹主动脉采血，每只大鼠取大脑，大脑取下后放入液氮里速冻，最后放入-80℃保存。

1.7血清生化分析

全自动生化分析仪检测大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CERA)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG),记录数据。

1.8 ELISA

按照说明书做好加样前的准备工作，每只大鼠50μl血清加入对应孔内，之后加入50μl检测抗体，封板，放在摇床上室温孵育2 h后洗液洗板6次。每孔加入100μl检测缓冲液稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，封板，室温孵育45 min后洗液洗板6次。每孔加入100μl的显色底物四甲基联苯胺(TMB),室温孵育5～30 min后，加入100μl终止液，用酶标仪测光密度(OD)值。

1.9 Western印迹检测

每组大鼠(随机选取6只)的下丘脑在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，用裂解液裂解，4℃离心收集上清液，用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。取60μg样品上样，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜，5%脱脂奶粉封闭1～2 h,加入AgRP和CART,GAPDH抗体(1∶1 000);4℃孵育过夜，Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)洗膜10 min×3次后，孵育对应的二抗1 h, TBST洗膜10 min×9次后，将化学发光液A、B混合，滴加到膜上孵育1 min,然后机器曝光。用ImageJ软件分析蛋白相对表达。

1.10 qRT-PCR

每组大鼠(随机选取6只)下丘脑组织在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，用Trizol裂解液裂解后提取RNA。用逆转录酶仪器将RNA (1μg)转录成cDNA。qRT-PCR采用瑞士罗氏应用科学公司的LightCycler序列检测系统，循环条件为：95℃300 s, 95℃10 s, 60℃30 s, 40个循环。根据Ct值利用公式2-ΔΔCt计算每个基因表达。引物序列为：AgRP上游：5′-CAGCAGACCGAGCAGAAGATGT-3′,下游：5′-GCACAGGTCGCA-GCAAGGT-3′;CART上游：5′-TGACATCATAACCCGGAAAACA-3′,下游：5′-AATTTGCACATGCTTCCA-TTTG-3′;18S上游：5′-TTCGGAAC TGAGGCCATGAT-3′,下游：5′-CGAACCTCCGACTT TCGTTC-3′。

1.11统计学分析

采用GraphPad version6.0软件进行ANOVA方差分析及独立样本t检验、Pearson相关分析。

2、结果

2.1丹参酮对去卵巢大鼠体质量和摄食的影响

各组初始体质量无明显差异。与假手术组比较，去卵巢组体质量(10 d开始)和体质量增长平均值明显增加(P<0.05),而补充雌激素(10 d开始)和丹参酮(25 d开始)可明显降低去卵巢引起的体质量增加(P<0.05),但是丹参酮效果弱于雌激素。与假手术组比较，去卵巢组每日摄食量明显增加(P<0.05),而补充雌激素和丹参酮可以明显降低去卵巢引起的大鼠每日摄食量增加(P<0.05)。大鼠体质量的增加和摄食总量正相关，摄食量越多体质量越重(P<0.05)。表明丹参酮可以抑制去卵巢引起的大鼠体质量增加，可能与丹参酮降低去卵巢大鼠摄食有关。见图1、表1、表2。

图1各组体质量增长和摄食量的关系

表1各组给药后不同时间体质量比较

2.2丹参酮对去卵巢大鼠子宫重量和血清雌激素的影响

与假手术组相比，去卵巢组子宫重量和血清雌激素水平明显降低(P<0.05),而补充雌激素可明显逆转去卵巢引起的大鼠子宫重量和血清雌激素水平降低(P<0.05),但是丹参酮无此作用。表明丹参酮不能提高去卵巢大鼠体内雌激素的含量。见表2。

2.3丹参酮对去卵巢大鼠肝肾功能的影响

去卵巢组血清ALT、AST、CERA、BUN水平与假手术组差异无统计学意义(P>0.05),补充雌激素和丹参酮后，以上指标差异仍无统计学意义(P>0.05)。表明去卵巢对大鼠肝肾功能无明显影响，外源性雌激素和丹参酮也不会对去卵巢大鼠肝肾功能造成影响。见表2。

表2各组体质量增长、每日摄食量、子宫重量、血清雌激素、ALT、AST、BUN、CREA比较

2.4丹参酮对去卵巢大鼠血糖、血脂的影响

与假手术组比较，去卵巢组GLU和TC水平无明显差异(P>0.05),但是血清TG水平明显升高(P<0.05);补充雌激素和丹参酮不明显改变去卵巢大鼠GLU和TC水平，但是明显降低去卵巢导致的血清TG水平的升高(P<0.05)。表明丹参酮可以改善去卵巢导致的血清TG水平增加，而对GLU和TC无影响。见表3。

2.5丹参酮对去卵巢大鼠血清瘦素和TNF-α水平的影响

与假手术组比较，去卵巢组血清瘦素和TNF-α水平明显上升(P<0.05),补充雌激素和丹参酮可明显降低去卵巢导致的血清瘦素和TNF-α水平上升(P<0.05)。表明丹参酮可以抑制去卵巢导致的血清瘦素和TNF-α水平上升。见表3。

2.6丹参酮对去卵巢大鼠下丘脑摄食因子mRNA和蛋白的影响

去卵巢组下丘脑AgRP mRNA和蛋白表达明显高于假手术组，CART mRNA和蛋白表达明显低于假手术组(P<0.05),提示去卵巢大鼠存在因下丘脑摄食中枢摄食调节异常导致的食欲亢进。与去卵巢组比较，雌激素组和丹参酮组AgRP mRNA和蛋白表达明显下降，CART mRNA和蛋白表达明显上升(P<0.05)。表明丹参酮可以改善去卵巢导致的大鼠食欲亢进。见表3、图2。

表3各组血清GLU、TC、TG、瘦素、TNF-α、AgRP、CART mRNA及蛋白水平比较

图2 Western印迹检测各组AgRP、CART蛋白表达

3、讨论

丹参酮是一类从丹参中提取的脂溶性天然化合物，丹参酮有许多的生理功能，如在心血管疾病、抗炎和免疫调节、抗肿瘤及肝脏保护方面应用广泛[4,9,12,14]。本研究发现，丹参酮通过调节下丘脑摄食基因降低大鼠的摄食量，降低血清TG水平，抑制去卵巢导致的大鼠体质量增加。研究表明，丹参水提取物可以降低去卵巢大鼠体质量[15],与本研究结果一致。本研究结果发现，丹参酮可以通过降低大鼠摄食量抑制去卵巢大鼠体质量，且雌激素和丹参酮都可以降低去卵巢大鼠体质量，丹参酮是通过雌激素样作用还是其他机制发挥作用的需要进一步明确。研究表明，去卵巢大鼠体内会存在糖脂代谢紊乱，加剧去卵巢大鼠肥胖[16]。本研究发现，去卵巢大鼠血脂水平发生紊乱，这跟去卵巢大鼠摄食量增加有关，而丹参酮减少摄食量，降低去卵巢大鼠血脂水平，改善脂代谢紊乱。

瘦素是脂肪细胞分泌的一种肽类激素，以单体形式存在于血液，影响代谢平衡、免疫和神经内分泌功能。机体脂肪含量增多后，瘦素分泌增加，由血液循环进入下丘脑，机体减少进食并增加能量消耗，以维持自身脂肪含量处于一种稳定状态[17]。肥胖患者脂肪含量增多，瘦素水平显著高于正常人，但是循环中过量的瘦素却不能正常地活化瘦素信号通路，瘦素抵抗导致食欲亢进，从而加重肥胖[18]。本研究发现，大鼠去卵巢以后体内瘦素明显增加，但是大鼠体质量也明显增加，说明出现了瘦素抵抗。同时去卵巢大鼠体内炎性因子TNF-α也增加，去卵巢大鼠瘦素抵抗可能与体内炎性环境形成，瘦素调节的信号通路出现障碍有关。丹参酮可以改善去卵巢导致的瘦素水平增加，同时也能改善炎症环境。

下丘脑是人的摄食中枢，它通过整合机体营养水平、激素水平及自主神经系统等相关信息，判断机体的营养状态，并通过获得的信息调整机体的食物摄入量[19]。下丘脑摄食中枢主要有两类神经元，促进食欲的NPY/AgRP神经元和抑制食欲的POMC/CART神经元[20]。有研究表明，雌激素可通过调节下丘脑神经中枢食欲基因改善去卵巢大鼠肥胖[7],本研究发现，丹参酮可以抑制促进食欲的AgRP基因转录和翻译水平的表达，促进厌食的CART基因转录和翻译水平的表达，调节大鼠食欲，降低丹参酮大鼠摄食量。

综上所述，丹参酮可以抑制去卵巢后大鼠体质量的增加和血脂脂代谢，其可能是通过调控下丘脑摄食中枢AgRP/CART信号通路减少去卵巢大鼠摄食量实现的。

参考文献:

[13]陈娟,岳嘉,李忠.丹参酮对去卵巢大鼠体质量及其肝脏脂代谢的影响[J].沈阳药科大学学报,2022;39(10):1251-6.

[14]陈芬燕,郭韧,张毕奎.丹参酮ⅡA的心血管药理作用研究进展[J].中国中药杂志,2015;40(9):1649-53.

[15]岳嘉,常燕琴,蔺美玲,等.丹参对去卵巢肥胖大鼠的影响[J].中医研究,2016;29(4):63-6.

[17]董笑克.辣木叶醇提物调节ZDF大鼠下丘脑摄食中枢的机制研究[D].北京:北京中医药大学,2018.

[18]杨晓宁,张辰雨,王炳蔚,等.瘦素信号与瘦素抵抗机制研究进展[J].生理科学进展,2015;46(5):327-33.

[19]董笑克,刘铜华,郭翔宇,等.FoxO1对下丘脑摄食中枢的影响研究进展[J].现代生物医学进展,2017;17(9):1780-3,1800.

[20]王萍,张果.下丘脑AgRP神经元调控食欲和体重研究进展[J].科学通报,2018;63(30):3059-69.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(82160831);甘肃省中医药研究中心甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室(zyzx-2020-06); 2023江苏高校“青蓝工程”资助项目(苏教师函[2023]27号);

文章来源:岳嘉,张艳,李金娟,等.丹参酮抑制去卵巢肥胖大鼠体质量及其作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(09):2162-2166.